纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物測定試劑盒（膠乳增強(qiáng)免疫比濁法）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究

1、纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物測定試劑盒（膠乳增強(qiáng)免疫比濁法）主要生產(chǎn)工藝及反應(yīng)體系的研究實(shí)驗(yàn)?zāi)康难芯亢线m的纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物的生產(chǎn)工藝和最佳反應(yīng)體系。實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)思想纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物測定試劑盒（膠乳增強(qiáng)免疫比濁法）原理是樣本中的FDP抗原與試劑中的抗體結(jié)合，形成抗原抗體復(fù)合物，產(chǎn)生吸光度變化，膠乳試劑可特異性的增大該吸光度的變化，增大試劑的靈敏度。該吸光度變化的高低與樣本中的FDP的含量成正比，測定該吸光度，采用與校準(zhǔn)品比較，即能得出樣本FDP的含量。主要儀器及試劑材料D240全自動(dòng)生化分析儀/雷杜420全自動(dòng)生化分析儀生產(chǎn)商:南京神州英諾華醫(yī)療科技有限公司/深圳雷杜生命科學(xué)股份有限公司纖維蛋

2、白（原）降解產(chǎn)物校準(zhǔn)品FDP含量：84g/mL生產(chǎn)商：上海捷門生物技術(shù)合作公司批號：S2814-1實(shí)驗(yàn)內(nèi)容及程序纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物測定試劑盒主要生產(chǎn)工藝過程的研制及試劑盒反應(yīng)體系的建立分為三個(gè)部分：生產(chǎn)工藝的研制、試劑盒組成的研制、試劑盒反應(yīng)體系的建立。產(chǎn)品擬定標(biāo)準(zhǔn)：線性范圍：在擬定線性范圍內(nèi)，相關(guān)系數(shù)r0.99；準(zhǔn)確度：測定已知溯源的FDP質(zhì)控品，相對偏差（Bias%）25%；靈敏度：測定已知溯源的FDP質(zhì)控品12次，結(jié)果CV20%；精密度：測定已知溯源的FDP質(zhì)控品20次，結(jié)果CV15%。主要工藝描述原液的準(zhǔn)備購進(jìn)商品化的高效價(jià)纖維蛋白（原）降解產(chǎn)物抗體致敏膠乳，將其稀釋成合適的倍數(shù)，

3、作為試劑2備用。選擇合適的緩沖體系，加入一定量的增濁劑和穩(wěn)定劑作為試劑1備用。原液的驗(yàn)證購進(jìn)有溯源的定值校準(zhǔn)品，在生化分析儀上，將適量的校準(zhǔn)品加入試劑1中，在適宜的條件下，和試劑2反應(yīng)，根據(jù)校準(zhǔn)品濃度和吸光度做劑量/響應(yīng)曲線，得出一條持續(xù)上升的平滑曲線，即得到合格的原液。反應(yīng)體系的組成及其研究購進(jìn)有溯源并標(biāo)示有定值的校準(zhǔn)品；FDP含量：84g/ml生產(chǎn)商：上海捷門生物技術(shù)合作有限公司批號：?致敏膠乳的準(zhǔn)備抗體致敏膠乳：上海捷門生物技術(shù)合作有限公司提供用實(shí)驗(yàn)室PBS緩沖液（0.1mol/L，PH=7.4）將其倍半稀釋，分別稀釋成：3.5倍、3倍2.5倍、2倍、1.5倍。用上述已準(zhǔn)備好的不同稀釋倍

4、數(shù)FDP抗體致敏膠乳和稀釋好的校準(zhǔn)品在生化儀上進(jìn)行操作。實(shí)驗(yàn)方法空白管（B）標(biāo)準(zhǔn)管(S)樣品管(U)蒸餾水（L）5校準(zhǔn)品5樣本5試劑1225225225混勻，37孵育3-5min試劑2757575混勻，37孵育10秒后，讀取吸光度值A(chǔ)0，孵育5分鐘后，讀取吸光度值A(chǔ)1，計(jì)算A=A1-A0實(shí)驗(yàn)結(jié)果稀釋倍數(shù)校準(zhǔn)品濃度（g/mL）5.2510.521.042.084.03.532.52實(shí)驗(yàn)結(jié)論由上述測試結(jié)果可以看出，將FDP抗體致敏膠乳稀釋到?倍的時(shí)候高值出現(xiàn)下滑，因此本試劑的最高稀釋倍數(shù)為?倍,因此購進(jìn)上海捷門生物技術(shù)合作公司的FDP抗體致敏膠乳，選擇能夠稀釋?倍或以下倍數(shù)的致敏膠乳原料。緩沖體系

5、的選擇由于致敏膠乳的稀釋是PBS緩沖液，因此反應(yīng)的緩沖體系也選用相同濃度和PH值的緩沖液PH值的選擇經(jīng)過純化的抗體在常用的緩沖液中是穩(wěn)定的，PH值應(yīng)保持在中性左右。PH在7到8之間時(shí)，保存多年，對抗體也無實(shí)質(zhì)性的損害，可保證其活性的穩(wěn)定性。配制PH值分別為：7.0、7.4、7.8、8.0的PBS緩沖液，選擇稀釋了？倍的致敏膠乳抗體作為試劑2。按照2.2.1中的實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行操作。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果PH值校準(zhǔn)品濃度（g/ mL）5.2510.521.042.084.07.07.47.88.0實(shí)驗(yàn)結(jié)論由測試結(jié)果可以看出PH在7.4的時(shí)候線性是最好的，而且各相鄰濃度之間吸光度變化明顯，因此可以確定PH為7.4

6、時(shí)，是最佳的反應(yīng)環(huán)境。穩(wěn)定劑的選擇疊氮鈉價(jià)格低廉，原材供應(yīng)渠道廣，是實(shí)驗(yàn)室常用的穩(wěn)定劑，用量很少。因此選用疊氮鈉1g/L。PEG濃度PEG有促進(jìn)抗原抗體結(jié)合的作用，很多時(shí)候抗原抗體反應(yīng)緩慢，為了滿足臨床檢測的需求會(huì)加入適當(dāng)?shù)腜EG加快抗原抗體反應(yīng)速度，縮短檢測時(shí)間。 配制PEG濃度：0%、0.5%、1%、1.5%、2%的PBS緩沖液，并將配制好的緩沖液作為試劑1備用。選擇稀釋了3倍的致敏膠乳作為試劑2，按2.2.1方法操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果PEG(%)校準(zhǔn)品濃度（g/ mL）5.2510.521.042.084.000.511.52實(shí)驗(yàn)結(jié)論 由測試結(jié)果可以看出PEG濃度在0%的時(shí)候，線性是最好的，而且

7、各相鄰濃度之間吸光度變化明顯，因此可以確定PEG的濃度為0%時(shí)是最佳濃度。樣本的要求靜脈采血，將枸櫞酸鈉（0.11mol/L）與全血以1:9混合，避免氣泡產(chǎn)生。立即離心，不小于3000轉(zhuǎn)/分，離心10分鐘，收集上層血漿。如不能使用新鮮血漿，可在2-8攝氏度保存2天，或在-20攝氏度分量冰凍，避免反復(fù)凍融。試劑用量 確定R1和R2試劑加入的最佳比例。按確定的配方配制R1與R2試劑，并按產(chǎn)品標(biāo)準(zhǔn)要求，用校準(zhǔn)品按照2.2.1方法進(jìn)行檢測，比較各比例試劑的吸光度。4.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果R1：R2校準(zhǔn)品濃度（g/ mL）5.2510.521.042.084.0150:100180:90225:75280:70

8、4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 由測試結(jié)果可以看出試劑用量比例為225:75時(shí)線性是最好的，而且各相鄰濃度之間吸光度變化明顯，因此可以確定試劑比例為225:75為最佳比例。樣本用量取配制合格 的R1、R2試劑，用校準(zhǔn)品檢測，樣本用量分別按3ul、5ul、7ul、10ul進(jìn)行，R1和R2的用量為225:75，按照2.2.1方法檢測，比較各個(gè)樣本量的吸光度值。 5.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 樣本量（ul）校準(zhǔn)品濃度（g/ mL）5.2510.521.042.084.025810 5.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)論 由測試結(jié)果可以看出樣本量為5ul時(shí)線性是最好的，而且各相鄰濃度之間吸光度變化明顯，因此樣本量為5ul時(shí)是最佳的反應(yīng)量。反應(yīng)條件因

9、為免疫試劑是模仿體內(nèi)反應(yīng)，因此做一下幾種溫度的研究，25、37、40。6.1 實(shí)驗(yàn)結(jié)果溫度（）校準(zhǔn)品濃度（g/ mL）5.2510.521.042.084.02537406.2實(shí)驗(yàn)結(jié)論由測試結(jié)果可以看出，溫度為25反應(yīng)很緩慢，吸光度偏小，溫度為40反應(yīng)很迅速，但是高值分不開，溫度為37時(shí)反應(yīng)速度適宜，測試結(jié)果的線性也比較好，因此最佳的溫度確定為37。結(jié)論綜上所述，反應(yīng)體系成分組成如下：試劑10.1mol/L PBS緩沖液(PH=7.4)、1%NaN3、表面活性劑試劑240抗體致敏膠乳(稀釋3倍的)、0.1mol/L的PBS緩沖液1%NaN3、表面活性劑一、膠乳凝集實(shí)驗(yàn)方法1膠乳凝集實(shí)驗(yàn)：先加受

10、檢標(biāo)本，滴于反應(yīng)板上，再加致敏膠乳1滴，連續(xù)搖動(dòng)2-3min后觀察結(jié)果。膠乳凝集者為陽性，不凝集者為陰性。同時(shí)需做陰、陽性對照。2膠乳凝集抑制實(shí)驗(yàn)：在反應(yīng)板上先加受檢標(biāo)本1滴，再加1滴配對抗血清混勻，最后加1滴致敏膠乳懸液，連續(xù)搖動(dòng)2-3min觀察結(jié)果。膠乳凝集者為陰性，不凝集者為陽性。同時(shí)需做陰、陽性對照。二、致敏膠乳 HYPERLINK /yp/product-list-43.html t _blank 試劑的制備（物理吸附法）1先用 HYPERLINK /yp/product-list-67.html t _blank 蒸餾水將10%膠乳懸液稀釋至1-2%。繼將吸附物（抗原或 HYPERLINK /yp/product-list-383.