藥監(jiān)系統(tǒng)官方培訓(xùn) 2020年版中國藥典四部 微生物限度檢查及無菌檢查

1、2020年版中國藥典四部微生物限度檢查及無菌檢查 微生物限度檢查培養(yǎng)基適用性檢查無菌檢查答疑實(shí)驗(yàn)室環(huán)境要求概要一、微生物實(shí)驗(yàn)室環(huán)境 一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求 總體要求：各功能區(qū)域應(yīng)明確標(biāo)識，特別是菌種儲藏室、污染物處理區(qū)、陽性菌室等存在生物安全危害的區(qū)域。一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求 潔凈室要求：潔凈室作為藥品微生物實(shí)驗(yàn)室的核心區(qū)域，應(yīng)遠(yuǎn)離交通干道、廁所及污染區(qū)，應(yīng)選上、下水道及其他安裝適宜的位置。潔凈室與各配套功能區(qū)，包括清洗、培養(yǎng)基配制、消毒/滅菌、滅菌物品存放和傳輸、培養(yǎng)區(qū)域、結(jié)果觀察、試驗(yàn)菌實(shí)驗(yàn)和辦公室等，要集中，減少污染，便于管理和使用?？諝鈾C(jī)組或空氣凈化

2、系統(tǒng)：潔凈或無菌室應(yīng)配備獨(dú)立的空氣機(jī)組或空氣凈化系統(tǒng)，定期更換并保存記錄。潔凈區(qū) 、活菌操作區(qū)：在時間或空間上有效分隔不相容的實(shí)驗(yàn)活動?；罹僮鲄^(qū)：配備生物安全柜；病原微生物的分離鑒定工作在二級生物安全實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求潔凈實(shí)驗(yàn)室（環(huán)境監(jiān)測）：各潔凈級別空氣懸浮粒子的標(biāo)準(zhǔn) （通則9205表3）潔凈度級別懸浮粒子最大允許數(shù) / 立方米靜態(tài)動態(tài)0.5m5.0m0.5m5.0mA 級352020352020B 級3520293520002900C 級3520002900352000029000D 級352000029000不作規(guī)定不作規(guī)定一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理

3、功能區(qū)域要求無菌檢查應(yīng)在B級背景下的A級單層流潔凈區(qū)域或隔離系統(tǒng)中進(jìn)行。微生物限度檢查應(yīng)在不低于D級背景下的B級單向流空氣區(qū)域內(nèi)進(jìn)行潔凈度級別表面微生物A級1111B級10555C級1005025D級20010050一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求各潔凈級別物理參數(shù)建議標(biāo)準(zhǔn)（通則9205表1）潔凈度級別過濾完整性氣流組織空氣流速換氣次數(shù)壓差溫度相對濕度A級檢漏試驗(yàn)監(jiān)測周期24個月單向流監(jiān)測周期24個月0.25-0.50 m/s監(jiān)測周期12個月-潔凈區(qū)與非潔凈區(qū)之間壓差不小于10Pa;不同級別潔凈區(qū)之間的壓差不小于10Pa監(jiān)測周期每周一次20-24監(jiān)測周期每次實(shí)驗(yàn)45-65%監(jiān)測周期每次

4、實(shí)驗(yàn)B 級單向流 （靜態(tài)）監(jiān)測周期24個月非單向流 -單向流(靜態(tài) )0.25-0.50m/s監(jiān)測周期12個月非單向流 - 單向流-非單向流 -140-60h監(jiān)測周期12個月C 級非單向流 - -120-40h監(jiān)測周期12個月D 級非單向流 - -16-20 h監(jiān)測周期12個月一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求推薦的藥品潔凈實(shí)驗(yàn)室的監(jiān)測頻次及監(jiān)測項(xiàng)目通則（9205表2）受控區(qū)域采樣頻次監(jiān)測項(xiàng)目無菌隔離系統(tǒng)內(nèi)部每次實(shí)驗(yàn)空氣懸浮粒子 、浮游菌或沉降菌 、表面微生物（含手套）外部每半年一次空氣懸浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物微生物潔凈實(shí)驗(yàn)室A 級每次實(shí)驗(yàn)空氣懸浮粒子 、浮游菌、沉降菌 、表

5、面微生物（含手套及操作服）B 級每周一次空氣懸浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物（含手套及操作服）C 級每季度一次空氣懸浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物D 級每半年一次空氣懸浮粒子、浮游菌、沉降菌、表面微生物一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求生物安全實(shí)驗(yàn)室（BSL-2)：一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求 實(shí)驗(yàn)室應(yīng)建立潔凈室（區(qū)）和隔離系統(tǒng)的驗(yàn)證、使用和清潔維護(hù)標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程，對可能影響檢測結(jié)果的工作（如潔凈度驗(yàn)證及監(jiān)測、消毒、清潔維護(hù)等）能夠有效地控制、監(jiān)測并記錄。實(shí)驗(yàn)室對所用的消毒劑應(yīng)進(jìn)行效力驗(yàn)證并定期更換，消毒劑在使用前應(yīng)盡可能使用0.22m的無菌濾膜進(jìn)行除菌過濾。一、實(shí)驗(yàn)室

6、的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求無菌取樣的環(huán)境無菌取樣應(yīng)在無菌實(shí)驗(yàn)室內(nèi)進(jìn)行，特別是采用無菌生產(chǎn)的產(chǎn)品，應(yīng)有非常嚴(yán)格的無菌防護(hù)措施，避免在抽樣過程中造成微生物的污染。如果可能，所有的樣品包括非滅菌樣品均應(yīng)在具有無菌條件的特定抽樣間進(jìn)行無菌抽樣。一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求無菌潔凈室的運(yùn)行 建立使用登記制度 按潔凈室管理規(guī)范的要求制立SOP（開啟運(yùn)行、人員進(jìn)入程序、日常監(jiān)測、UV燈與過濾器定期更換等） 定期再驗(yàn)證管理與環(huán)境監(jiān)測計(jì)劃一、實(shí)驗(yàn)室的設(shè)施與環(huán)境管理 功能區(qū)域要求環(huán)境的清潔、消毒所用清潔、消毒劑的種類和使用規(guī)定規(guī)定清潔、消毒的頻次、方法；（每次試驗(yàn)/或每日、每周、每月等）建立清潔、

7、消毒記錄；實(shí)驗(yàn)室對所用的消毒劑種類應(yīng)定期更換，使用的消毒劑應(yīng)無菌。二、培養(yǎng)基適用性檢查 二、培養(yǎng)基適用性檢查微生物限度檢查1.計(jì)數(shù)培養(yǎng)基的適用性檢查：驗(yàn)證菌： TSA：金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、黑曲霉、 白色念珠菌 SDA：黑曲霉、白色念珠菌驗(yàn)證菌加入量：不大于100cfu培養(yǎng)基：待檢培養(yǎng)基、標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基方法：注皿法培養(yǎng)條件：TSA：3035，不超過3天 SDA：2025，不超過5天 促生長能力： 液體培養(yǎng)基：分別在待檢培養(yǎng)基和標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)基中加入目標(biāo)菌。 固體培養(yǎng)基：涂布法，不大于100cfu抑制能力： 大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、沙門菌對應(yīng)的對照菌是金黃色葡萄球菌；金黃色葡萄球菌

8、對應(yīng)的對照菌是大腸埃希菌； 溴化十六烷三甲胺瓊脂培養(yǎng)基和念珠菌顯色的對照菌是大腸埃希菌控制菌的培養(yǎng)基實(shí)用性檢查指示能力：指示能力：耐膽鹽革蘭陰性菌：紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基大腸埃希菌和銅綠假單胞菌大腸埃希菌：麥康凱瓊脂培養(yǎng)基沙門菌：木糖醇賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂培養(yǎng)基和三糖鐵瓊脂培養(yǎng)基 金黃色葡萄球菌：甘露醇氯化鈉瓊脂培養(yǎng)基白色念珠菌：沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基和念珠菌顯色培養(yǎng)基 二、培養(yǎng)基適用性檢查無菌檢查無菌性檢查每批培養(yǎng)基隨機(jī)抽取5瓶（支），各置相應(yīng)規(guī)定溫度培養(yǎng)14天，應(yīng)無菌生長。培養(yǎng)基靈敏度檢查1.硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基的適用性檢查：驗(yàn)證菌： 金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、生孢梭菌驗(yàn)證菌加入量：不

9、大于100cfu培養(yǎng)基量：12ml方法：直接接種法培養(yǎng)條件：3035，不超過3天 2.胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基的適用性檢查：驗(yàn)證菌： 枯草芽孢桿菌、白色念珠菌、黑曲霉驗(yàn)證菌加入量：不大于100cfu培養(yǎng)基量：9ml方法：直接接種法培養(yǎng)條件：2025，不超過5天三、微生物限度檢查 計(jì)數(shù)方法適用性檢查1.供試液的制備 水溶性供試品 非水溶性供試品：可適量加入如聚山梨酯80等表面活性劑，加入量及加入的試劑均需進(jìn)行驗(yàn)證，以證明其無明顯抑菌性。 油性供試品：十四烷酸異丙酯或其它無抑菌性的表面活性劑。 腸溶供試品：一般腸溶制劑用pH6.8磷酸鹽緩沖液，結(jié)腸制劑用pH7.6磷酸鹽緩沖液。 膜劑、貼膏劑：浸泡或振

10、搖30分鐘氣霧劑：在-20冷凍1小時候，將拋射劑完全放出后，再進(jìn)行試驗(yàn)。2.稀釋和接種菌液對照組稀釋液+菌液菌液的加入體積不超過1%最終菌液濃度為小于100cfu/ml供試品對照組供試液+稀釋液稀釋液的加入體積不超過1%試驗(yàn)組供試液+菌液菌液的加入體積不超過1%最終菌液濃度為小于100cfu/ml計(jì)數(shù)方法適用性檢查示意圖菌液組 H B K T J 稀釋液0.1ml菌液稀釋液需氧菌總數(shù)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基霉菌和酵母菌菌總數(shù)沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基計(jì)數(shù)方法適用性檢查示意圖試驗(yàn)組 H B K T J 1:10供試液0.1ml菌液1:10供試液需氧菌總數(shù)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基霉菌和酵母菌菌總數(shù)沙氏葡萄糖瓊脂

11、培養(yǎng)基計(jì)數(shù)方法適用性檢查示意圖供試品對照組 10ml 供試液1:10供試液0.1ml稀釋液需氧菌總數(shù)胰酪大豆胨瓊脂培養(yǎng)基霉菌和酵母菌菌總數(shù)沙氏葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基 稀釋級的選擇： 固體制劑：1:10的供試液 液體制劑：供試品原液微生物回收的方法： 傾注法：供試液1ml注入平皿中 涂布法：供試液不少于0.1ml3.抗菌活性的消除增加稀釋劑的量： 稀釋倍數(shù)應(yīng)低于該品種微生物限度標(biāo)準(zhǔn)增加培養(yǎng)基的體積： 可采用大皿，例如150mm的平皿加入適量的中和劑： 如聚山梨酯80，硫代硫酸鈉等薄膜過濾法： 對于無抑菌性的供試品，可在供試液中直接加入目標(biāo) 菌后進(jìn)行薄膜過濾；對于有抑菌性的供試液，可先進(jìn)行薄膜過 濾，最

12、后一次沖洗液中加入目標(biāo)菌。每張濾膜每次沖洗量一 般為100ml，沖洗總量不得超過1000ml. MPN法：僅用于需氧菌總數(shù)沒有適宜計(jì)數(shù)方法的情況下 九管法：連續(xù)3個稀釋級，取1ml供試液接種于910ml胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基，每級制備3份，置3035培養(yǎng)3天，觀察是否有微生物生長，查微生物最可能檢索表，得到供試品需氧菌總數(shù)的最可能數(shù)?？刂凭椒ㄟm用性供試品組：相當(dāng)于1g或1ml的供試液陽性對照組：相當(dāng)于1g或1ml的供試液+不大于100cfu的目標(biāo)菌陰性對照組：與供試液同體積的稀釋液耐膽鹽格蘭陰性菌檢查1.供試液制備和預(yù)培養(yǎng)：取供試品10g，加胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基至100ml，放置2025培養(yǎng)約

13、2小時內(nèi)。2.定性試驗(yàn)：取1:10的供試液10ml，加至腸道菌增菌培養(yǎng)基中（加入量應(yīng)經(jīng)過驗(yàn)證），此方法適用于標(biāo)準(zhǔn)為不得檢出的供試品。3.定量試驗(yàn)：三管法，同上述MPN法，每級稀釋級均取1ml加入一管培養(yǎng)基中。4.選擇與分離：取上述培養(yǎng)物劃線于紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上。5.結(jié)果判斷：若紫紅膽鹽葡萄糖瓊脂平板上有菌落生長，定性試驗(yàn)判斷是否檢出；定量試驗(yàn)則對應(yīng)培養(yǎng)管，查表確定供試品中含有耐膽鹽格蘭陰性菌的可能菌數(shù)。大腸埃希菌檢查增菌培養(yǎng)：1:10的供試液接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物1ml轉(zhuǎn)種至麥康凱液體培養(yǎng)基100ml中，4244培養(yǎng)2448小時，取此培養(yǎng)物劃線于麥康凱

14、瓊脂平板上。結(jié)果判斷：如有菌生長，應(yīng)進(jìn)行鑒定試驗(yàn)判定是否檢出大腸埃希菌。沙門菌檢查增菌培養(yǎng)：供試品10g直接接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物0.1ml轉(zhuǎn)種至RV沙門增菌液體培養(yǎng)基10ml中，3035培養(yǎng)1824小時，取此培養(yǎng)物劃線于木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上。 木糖賴氨酸脫氧膽酸鹽瓊脂平板上沙門菌菌落形態(tài)：淡紅色或無色，透明或半透明，中心有或無黑色。 結(jié)果判斷：如可疑菌落生長，應(yīng)挑取可以菌落轉(zhuǎn)種于三糖鐵瓊脂培 養(yǎng)基斜面上。若三糖鐵瓊脂斜面出現(xiàn)：斜面為紅色，底層為黃色斜面及底層均為黃色 黑色 應(yīng)進(jìn)行鑒定試驗(yàn)判定是否檢出沙門菌，如血清學(xué)試驗(yàn)，微生物全自動鑒定系統(tǒng)等。銅

15、綠假單胞菌檢查增菌培養(yǎng)：1:10的供試液接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物劃線于溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板上。溴化十六烷基三甲銨瓊脂平板菌落形態(tài)：草綠色，扁平，蔓延生長。結(jié)果判斷：如有可疑菌落生長，進(jìn)行氧化酶實(shí)驗(yàn)，銅綠假單胞菌氧化酶實(shí)驗(yàn)陽性。金黃色葡萄球菌檢查增菌培養(yǎng)：1:10的供試液接種至胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基中。選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物劃線于甘露醇氯化鈉瓊脂平板上。甘露醇氯化鈉瓊脂平板菌落形態(tài)：金黃色或黃白色，菌落周圍有黃色環(huán)。結(jié)果判斷：如有可疑菌落生長，應(yīng)進(jìn)行鑒定試驗(yàn)判定是否金黃色葡萄球菌，常使用血漿凝固酶試驗(yàn)。梭菌檢查供試液熱處理：取1:10的供試液2份，其中

16、一份置80保溫10分鐘后迅速冷卻。增菌培養(yǎng)：將2份1:10的供試液分別接種至梭菌增菌培養(yǎng)基中。選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物少量分別涂布于哥倫比亞瓊脂平板上。結(jié)果判斷：如有可疑菌落生長，應(yīng)進(jìn)行過氧化酶試驗(yàn)，如過氧化酶試驗(yàn)陰性，再進(jìn)行鑒定試驗(yàn)判定是否檢出梭菌。白色念珠菌增菌培養(yǎng)：1:10的供試液接種至沙氏葡萄糖液體培養(yǎng)基中。選擇和分離培養(yǎng)：取上述培養(yǎng)物劃線于沙氏葡萄糖瓊脂平板上。沙氏葡萄糖瓊脂平板菌落形態(tài)：白色，偶見淡黃色，表面光滑，有濃酵母味。結(jié)果判斷：如有可疑菌落生長，取可疑菌落劃線于念珠菌顯色平板上。四、無菌檢查 四、無菌檢查法1.直接接種法2.薄膜過濾法只要供試品性質(zhì)允許，應(yīng)采用薄膜過濾法

17、若需要適用表面活性劑、中和劑等試劑，應(yīng)證明其有效性，且對微生物無毒性。無菌檢查(直接接種法）原理示意圖 供試液硫乙醇酸鹽 1支硫乙醇酸鹽10支 TSB 10支培養(yǎng)基30-35 培養(yǎng)3天20-25 培養(yǎng)14天陽性對照菌小于100CFU30-35 培養(yǎng)14天無菌檢查(薄膜過濾法）原理示意圖 供試液硫乙醇酸鹽硫乙醇酸鹽 TSB沖洗液培養(yǎng)基30-35 培養(yǎng)14天20-25 培養(yǎng)14天陽性對照菌小于100CFU30-35 培養(yǎng)3天1.稀釋液0.1%無菌蛋白胨水溶液 pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液 稀釋液選擇原則：根據(jù)供試品特性，經(jīng)過驗(yàn)證的適宜溶液 可在稀釋液中加入表面活性劑或中和劑 2.取樣量 四、方法適用性檢查目的 確認(rèn)所采用的方法適合于供試品的無菌檢查。即確認(rèn)供試品在該檢驗(yàn)量、該檢驗(yàn)條件下無抑菌活性或其抑菌活性以已被充分消除到可以忽略不計(jì)。 保證檢驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確、可靠及檢驗(yàn)方法的完整性。何時需驗(yàn)證驗(yàn)證時間 建立方法處方發(fā)生改變工藝發(fā)生改變原檢驗(yàn)條件 發(fā)生改變 預(yù)實(shí)驗(yàn)小結(jié)實(shí)驗(yàn)用品方法學(xué)驗(yàn)證 確定的方法 薄膜過濾法驗(yàn)證步驟取規(guī)定量直接過濾(