糖皮質(zhì)激素致星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的快速升高

1、糖皮質(zhì)激素致星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣濃度的快速升高李茂全，王艷艷，楊書，陳朝瓊，楊曉虹，余爭(zhēng)平【關(guān)鍵詞】應(yīng)激；糖皮質(zhì)激素；星形細(xì)胞；鈣Rapidelevatinfintraellularfreealiunentratininastrytesaftertreatedbyglurtiid【Abstrat】AI:Texplretheehanissfglurtiid(G)leadingttheelevatinfintraellularfreealiunentratin(a2+i)inastrytesinearlyeffetphase.ETHDS:Aellulturedelfnenatalistarrathip

2、papalastrytesasused.Afterexpsedtrtisterne(RT)(1l/L),NethylDaspartate(NDA),K801andBSART,respetively,hangesfa2+iinastryteserebservedbylasernfalirspe.RESULTS:RTinduedrapidelevatinfintraellulara2+flureseneintensityithin10in177.13.8，P0.01)paredithntrls(141.24.7),butinduednsignifianthangehenthereasna2+utf

3、theell148.56.3).NDAausedfurtherinreasefintraellulara2+afterpretreatentithRT(195.37.2，P0.01).K801partiallysuppressedtheprlngedintraellulara2+elevatin(186.41.8).BSARThadalstthesaeeffetastheRTtreatent200.712.2,P0.01).NLUSIN:TherapideffetfGinduessignifianta2+ielevatininastrytesduringstress,andaybeNDAree

4、ptrinvlvesinthispress.【Keyrds】stress;glurtiid;astrytes;aliu【摘要】目的：研究應(yīng)激程度的糖皮質(zhì)激素G在早期快速效應(yīng)中對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)游離a2+濃度a2+i的影響及作用機(jī)制.方法：原代培養(yǎng)新生istar大鼠海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞，用1l/L的皮質(zhì)酮(RT)處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，激光共聚焦顯微鏡下觀察RT快速作用致星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)游離a2+i的變化，并設(shè)立N甲基D天冬氨酸(NDA)，受體拮抗劑5甲基二氫丙環(huán)庚烯亞胺馬來酸(K801)，牛血清白蛋白偶聯(lián)RTBSART及無細(xì)胞外鈣等干預(yù)組,進(jìn)一步檢測(cè)a2+i變化.結(jié)果：與未處理對(duì)照細(xì)胞141.24.7相比，

5、RT可快速介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度增加177.13.8，P0.01)，但細(xì)胞外鈣為零時(shí)無明顯變化148.56.3；NDA受體激活可使熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng)(195.37.2，P0.01)，NDA受體拮抗劑K801可局部拮抗熒光強(qiáng)度升高(186.41.8)；BSART可產(chǎn)生與RT類似的效應(yīng)200.712.2，P0.01).結(jié)論：應(yīng)激程度的G在早期可快速增加星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)a2+i，激活NDA受體是其中的重要機(jī)制之一.【關(guān)鍵詞】應(yīng)激；糖皮質(zhì)激素；星形細(xì)胞；鈣星形膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)entralnervussyste,NS內(nèi)數(shù)量最多的細(xì)胞，廣泛參與NS內(nèi)信息的處理與傳導(dǎo)，并在神經(jīng)退行性疾并腦老化及

6、外傷、炎癥等病變的發(fā)生開展中扮演重要角色1.糖皮質(zhì)激素glurtiid，G發(fā)揮作用可通過早期30in以內(nèi)的非基因組效應(yīng)和后期的基因組效應(yīng)2.有文獻(xiàn)報(bào)道，G的基因組效應(yīng)可增加星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)游離a2+濃度a2+i3，a2+作為重要的胞內(nèi)信使，對(duì)細(xì)胞功能、信號(hào)傳遞及神經(jīng)遞質(zhì)釋放具有重要意義.目前關(guān)于應(yīng)激時(shí)G對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用機(jī)理，尤其是G的非基因組效應(yīng)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞a2+i的影響少見報(bào)道.本實(shí)驗(yàn)選用應(yīng)激濃度的皮質(zhì)酮(rtisterne,RT)，應(yīng)用激光共聚焦顯微鏡觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)早期a2+程度的變化，初步討論應(yīng)激情況下G非基因組作用階段對(duì)a2+的影響及機(jī)制.1材料和方法1.1材料出生2d以內(nèi)的

7、新生近交系istar大鼠，由第三軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供;ID培養(yǎng)基(美國(guó)Gib公司)；胎牛血清(天津TBD公司；胰蛋白酶和EDTA(美國(guó)Ares公司)；生物素標(biāo)記抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillaryaidprtEin,GFAP)Ab(北京中山生物技術(shù)公司；藻紅蛋白(Phyerythrin,PE)標(biāo)記鏈霉親和素美國(guó)eBisiene公司；RT，N甲基D天冬氨酸(NethylDaspartate,NDA)和其受體拮抗劑5甲基二氫丙環(huán)庚烯亞胺馬來酸(K801)，牛血清白蛋白偶聯(lián)RT(BSART)(美國(guó)Siga公司)；Flu3/A和plurniF127(美國(guó)leularPrbes公司

8、)；XTL3A型解剖顯微鏡江蘇鎮(zhèn)江電子儀器廠；DIRB型熒光顯微鏡和TSNT激光共聚焦顯微鏡(德國(guó)Leia公司).1.2方法1.2.1大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)及鑒定無菌條件下取出大鼠雙側(cè)海馬，置于4的0.01l/LPBS緩沖液中，在解剖顯微鏡下剝除腦膜及血管，剪碎后用2.5g/L的胰酶和等體積1l/L的EDTA在37消化20in，終止消化后吸管吹打，100目篩網(wǎng)機(jī)械過濾，制備為混合細(xì)胞懸液，離心搜集沉淀，將細(xì)胞密度調(diào)至5107個(gè)/L，加至鋪被了多聚賴氨酸的塑料培養(yǎng)瓶中.第2日換液去除死亡細(xì)胞碎片，不換液繼續(xù)培養(yǎng)56d，置于37恒溫?fù)u床中180r/in振搖1215h，去除上清中的小膠質(zhì)細(xì)胞和少

9、突膠質(zhì)細(xì)胞，余下貼壁的為星形膠質(zhì)細(xì)胞.將細(xì)胞接種在無菌培養(yǎng)皿內(nèi)的蓋玻片上，24h后采用間接免疫熒光法進(jìn)展單層細(xì)胞染色，GFAP呈陽性確定為星形膠質(zhì)細(xì)胞.用熒光顯微鏡在200倍視野下隨機(jī)計(jì)數(shù)200個(gè)細(xì)胞，計(jì)算陽性細(xì)胞百分率.1.2.2RT對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞a2+i的影響當(dāng)接種于蓋玻片上的細(xì)胞交融至80%時(shí)換用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，實(shí)驗(yàn)隨機(jī)分為五組：未處理對(duì)照組；1l/LRT處理10in組；外鈣為零時(shí)1l/LRT處理10in組；1l/LRT10in+100l/LNDA12in10l/LK8018in處理組；1l/LBSART處理10in組.其中第組用無a2+和g2+的DHanks液清洗細(xì)胞3次，再用

10、DHanks液配制Flu3/A(1l/L)和20%(/V)的F127加于細(xì)胞上,使熒光探針均勻分布于細(xì)胞，在37的2培養(yǎng)箱內(nèi)避光負(fù)載30in.然后用DHanks液輕洗細(xì)胞3次去除未進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)的熒光探針,其他4組中的DHanks液均用無g2+但含a2+的平衡鹽溶液(130l/LNal,5.4l/LKl,2.0l/Lal2,5.5l/Lgluse,10l/Lglyine,10l/LHepes,pH=7.3)代替.在激光共聚焦顯微鏡下動(dòng)態(tài)掃描細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度變化激發(fā)波長(zhǎng)488n，發(fā)射波長(zhǎng)530n，以間隔12s的速度掃描，記錄不同時(shí)間細(xì)胞內(nèi)a2+i濃度變化某一層面的熒光圖像.待細(xì)胞內(nèi)a2+i到達(dá)穩(wěn)態(tài)后，

11、按以上的干預(yù)因素進(jìn)展分組實(shí)驗(yàn).由LeiaTS圖像分析系統(tǒng)對(duì)所選取細(xì)胞的平均熒光強(qiáng)度進(jìn)展數(shù)據(jù)采集，畫出其隨時(shí)間變化的曲線.由于Flu3結(jié)合鈣離子后其熒光強(qiáng)度與細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度成正比,因此取每個(gè)細(xì)胞熒光強(qiáng)度測(cè)定值平均數(shù)表示該細(xì)胞內(nèi)游離鈣離子濃度,每個(gè)處理組隨機(jī)選擇6個(gè)細(xì)胞動(dòng)態(tài)掃描細(xì)胞內(nèi)a2+i的熒光強(qiáng)度,取平均值.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:所有計(jì)量資料以xs表示，采用SPSS10.0軟件的neayANVA進(jìn)展統(tǒng)計(jì)學(xué)分析,選用LSDt檢驗(yàn)法完成組間比擬.2結(jié)果2.1原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的純度鑒定體外原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞，在顯微鏡下呈單層生長(zhǎng)，互不重疊.采用間接免疫熒光法檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的特征性抗原GFAP，結(jié)果顯

12、示表達(dá)陽性率95%.提示所別離的星形膠質(zhì)細(xì)胞純度高圖1.圖1間接免疫熒光法鑒定培養(yǎng)的海馬星形膠質(zhì)細(xì)胞純度2002.2RT處理星形膠質(zhì)細(xì)胞引起細(xì)胞內(nèi)鈣的動(dòng)態(tài)變化熒光指示劑Flu3與游離鈣結(jié)合后，在激光共聚焦顯微鏡下可見處理前星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)較低的熒光強(qiáng)度141.24.7，參加1l/LRT處理10in星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度有顯著增強(qiáng)177.13.8，P0.01，圖2.但外鈣為零時(shí)，熒光強(qiáng)度無明顯變化148.56.3，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.說明RT誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣升高是以外鈣內(nèi)流為主而非內(nèi)鈣釋放圖3.2.3RT處理星形膠質(zhì)細(xì)胞及NDA，K801A:未處理對(duì)照組;B:1l/LRT處理10in組.2.4B

13、SART處理星形膠質(zhì)細(xì)胞引起細(xì)胞內(nèi)鈣的變化結(jié)果顯示，參加1l/LBSART處理星形膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)200.712.2，影響具有顯著性P0.01，圖5).3討論星形膠質(zhì)細(xì)胞在NS內(nèi)的代謝、營(yíng)養(yǎng)、支持、調(diào)節(jié)突觸等活動(dòng)中發(fā)揮重要作用.G的急性升高一方面可能通過快速效應(yīng)直接損傷神經(jīng)元的功能；另一方面，G對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的快速作用間接損傷神經(jīng)元的功能.本實(shí)驗(yàn)選擇星形膠質(zhì)細(xì)胞的內(nèi)鈣變化作為效應(yīng)指標(biāo)，觀察其動(dòng)態(tài)變化的過程.由于星形膠質(zhì)細(xì)胞的A:未處理對(duì)照組;B:1l/LBSART處理10in組.圖5BSART處理星形膠質(zhì)細(xì)胞引起細(xì)胞內(nèi)鈣變化內(nèi)鈣升高主要有兩種途徑：外鈣內(nèi)流；內(nèi)鈣釋放.實(shí)驗(yàn)中用1

14、l/L應(yīng)激濃度的RT處理星形膠質(zhì)細(xì)胞可引起細(xì)胞內(nèi)鈣明顯升高,但外鈣為零時(shí)無此效應(yīng),說明RT誘導(dǎo)的外鈣內(nèi)流是星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣升高的重要原因.由于G的升高引起谷氨酸的釋放增加4，谷氨酸通過多種途徑影響星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣信號(hào)，激活NDA受體是其中的重要機(jī)制之一5，且NDA受體是影響星形膠質(zhì)細(xì)胞功能的重要通路6-7，我們?yōu)橛^察NDA受體在G快速誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣升高中的作用，明確G引起星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣升高的外鈣內(nèi)流機(jī)制，先用RT處理10in，參加100l/LNDA作用12in激活其受體,結(jié)果NDA單獨(dú)也可快速介導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣升高,并對(duì)RT誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣升高有協(xié)同作用,說明NDA受體參與了RT

15、引起的細(xì)胞內(nèi)鈣升高,但同時(shí)K801只局部抑制了內(nèi)鈣升高，提示RT可能存在其它途徑作用于鈣信號(hào).由于BSART分子量大，不能穿透細(xì)胞膜，所以BSART是通過非基因組效應(yīng)結(jié)合細(xì)胞膜上的作用位點(diǎn)發(fā)揮快速作用.BSART產(chǎn)生了與RT類似的效應(yīng)，進(jìn)一步說明RT誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣升高是由G的快速非基因組效應(yīng)介導(dǎo)的.本研究結(jié)果從不同側(cè)面提示G快速升高星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣屬非基因組效應(yīng)，從而提醒了G快速效應(yīng)和星形膠質(zhì)細(xì)胞功能之間可能存在的關(guān)系,以及G存在非基因組效應(yīng)的功能意義，為進(jìn)一步研究G對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞和神經(jīng)元功能的調(diào)節(jié)提供根據(jù).【參考文獻(xiàn)】1Nedergaard,RansB,GldanSA.Nerlesf

16、rastrytes:RedefiningthefuntinalarhiteturefthebrainJ.TrendsNeursi,2022,26(10):523-530.2趙艷紅,周晉,賈智艷,等TNF對(duì)人糖皮質(zhì)激素受體表達(dá)的影響J第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào)，2022，2617：1547-1549.3arieSI,illiaT,uld,etal.GlurtiidsptentdulatrsfastrytialiusignalingJ.Glia,1999,28(1):1-12.4EenBS.StressandhippapalplastiityJ.AnnuRevNeursi,1999,22:105-122.5胡波，孫圣剛，何立銘,等.谷氨酸誘發(fā)培養(yǎng)的大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣升高的機(jī)制J.中國(guó)神經(jīng)科學(xué)