白芍總苷和當歸提取物對離體肝細胞凋亡的保護作用

1、白芍總苷和當歸提取物對離體肝細胞凋亡的保護作用陳象青謝軍方焱張善堂劉圣【摘要】目的觀察白芍總苷和當歸提取物合用對離體肝細胞凋亡的保護作用。方法采用甲醛誘導小鼠離體肝細胞凋亡。結果白芍總苷和當歸提取物合用可抑制小鼠肝細胞凋亡。結論白芍總苷和當歸提取物合用對小鼠離體肝細胞凋亡有一定的保護作用?！娟P鍵詞】白芍總苷當歸提取物甲醛凋亡Abstrat:bjetiveTstudytheprtetiveeffetsfttalglusidesfPaenyandextratfrAngeliasinensisnhepatyteapptsis.ethdsHepatyteapptsisfieasinduedbyHh.R

2、esultsTGPandEASuldinhibithepatyteapptsisfieinvitr.nlusinTGPandEAshaveaprtetiveeffetnthehepatyteapptsis.Keyrds:Ttalglusidesfpaeny；ExtratfrAngeliasinensis；Hh；Apptsis乙型肝炎是由乙型肝炎病毒HepatitisBVirus,HBV引起的一種嚴重的世界范圍內(nèi)危害人類安康的疾病，HBV持續(xù)感染會導致肝硬化和原發(fā)性肝細胞肝癌等肝臟疾病，死亡率很高。T已把乙肝列為世界第九死因，尋找平安有效的抗HBV藥物已成為當今醫(yī)藥學界一項迫切任務。由于中藥治療

3、能有效地改善病癥體征，副作用少，醫(yī)療費用較低，使用方便，因此是目前治療乙肝患者及無病癥病毒攜帶者的主要方法之一。有研究說明，病毒性肝炎的發(fā)病機制與肝細胞凋亡親密相關1，2，目前認為,病毒感染后,產(chǎn)生肝細胞凋亡的機制可能有以下幾個方面:TL可通過Fas/FasL及穿孔素/端粒酶B途徑引起肝細胞凋亡。爆發(fā)性肝衰竭早期,TL的這種作用,使肝細胞大量凋亡,繼而出現(xiàn)肝細胞壞死,肝功能衰竭。亞急性和慢性重型肝炎時,一些肝細胞增殖抑制因子分泌升高,如TGF、TNF-等對增殖的肝細胞也有很強的誘導凋亡作用,肝細胞的大量凋亡可能是肝再生不良的重要原因之一。實驗性爆發(fā)性肝衰竭中,乙肝病毒抗原特異性TL同乙肝病毒轉

4、基因小鼠肝細胞作用,可引起大量肝細胞迅速凋亡。因此，本人擬通過對小鼠離體肝細胞凋亡保護作用的研究，尋找平安有效的抗HBV中藥。1材料與方法1.1藥品與試劑白芍總苷TGP由安徽醫(yī)科大學饋贈；當歸提取物EAS由大東方藥業(yè)有限責任公司提取，批號：20220816，每克相當于生藥5.9g，比重為1.30；云芝多糖由南京同仁堂藥業(yè)有限責任公司饋贈，批號：050124；甲醛由蚌埠生化試劑廠出品，批號：050407；ulterDNA-PrepReagentsKit試劑盒DNA-PrepLPR固定液、DNA-Prepstain染料為法國庫爾特公司產(chǎn)品。1.2儀器自動平衡微型離心機北京醫(yī)用離心機廠；ulter-

5、XL/EPIS型流式細胞儀美國貝克曼公司。1.3動物昆明種小鼠，雄性，4周齡，安徽省醫(yī)學研究所動物科提供，合格證：皖醫(yī)實動準字第01號。1.4甲醛致小鼠離體肝細胞凋亡模型的制備選用4周齡的昆明系雄性小鼠，脫頸椎處死后，取221左右小塊肝左葉組織，加5lNS，在200目濾網(wǎng)上研磨，并不斷過濾，吹打成單細胞，4000r/in離心5in，棄去上清液，殘液振勻，取10l細胞液，加5l1%甲醛，24冷藏15in，4000r/in離心5in，棄去上清液，殘液分別加5lNS清洗，離心，去上清液，各管均洗2次，棄去上清液，殘液加50lDNA-PrepLPR固定液，振蕩，加450lDNA-Prepstain染料

6、，避光30in，用流式細胞儀檢測3，4，并與加5lNS組比擬。1.5TGP+EAS預防治療甲醛誘導的肝細胞凋亡用藥方案取4周齡的昆明系雄性安康小鼠24只，隨機分為4組：正常對照組，模型組，TGP+EAS組，云芝多糖組，每組6只。組每天ig相應藥物，容積為0.2l/10g體質量，組每天ig給予等容量NS，連續(xù)7d，第7天給藥前禁食自由飲水12h，給藥2h后，脫頸椎處死動物。各取221左右小塊肝左葉組織，加5lNS，在200目濾網(wǎng)上研磨，并不斷過濾，吹打成單細胞，4000r/in離心5in，棄去上清液，殘液振勻，取10l細胞液，組加5lNS，組各加5l1%甲醛，24冷藏15in，4000r/in離

7、心5in，棄去上清液，殘液分別加5lNS清洗，離心，去上清液，各管均洗2次，棄去上清液，殘液加50lDNA-PrepLPR固定液，振蕩，加450lDNA-Prepstain染料，避光30in，用流式細胞儀檢測。2結果2.1對1%甲醛誘導的小鼠肝細胞凋亡的保護作用由于甲醛是作用強烈的凋亡誘導劑，模型組肝細胞凋亡率到達77.1%，由于EAS+TGP和陽性藥物云芝多糖的保護作用，這兩組的肝細胞凋亡率分別為46.8%和48.4%。結果見表1及圖14。表11%甲醛對各組離體肝細胞周期和凋亡的影響略圖1正常組略圖2模型組略圖3藥物組略圖4陽性對照組略3討論本研究首先根據(jù)ulter公司提供的資料，將離體小鼠

8、肝細胞置于3%甲醛中，冷藏30in，誘導其凋亡，但發(fā)現(xiàn)作用過于強烈，凋亡或壞死幾乎到達100%，便加以改良，采用1%甲醛，冷藏15in，由表1及圖14可發(fā)現(xiàn)模型組肝細胞凋亡率為77%左右，而TGP+EAS組和陽性藥物云芝多糖組肝細胞凋亡率明顯下降46.8%，48.4%，同時G1期所占比例由模型組的17.6%上升到38.7%，36.1%，G2/期所占比例由模型組的5.3%上升到12.3%，11.9%，說明TGP和EAS合用對離體小鼠肝細胞凋亡有一定的保護作用。很多研究說明肝細胞凋亡是肝臟疾病病理變化過程中的普遍現(xiàn)象，研究肝細胞凋亡對于預防和治療肝臟疾病極為重要，細胞凋亡過程中具有其獨特和復雜的生

9、物化學和分子生物學機制，氧自由基、核酸內(nèi)切酶以及調控基因均參與細胞凋亡，尋求抗細胞凋亡的藥物已受到國內(nèi)外學者的關注。近年來，隨著天然藥物研究熱的興起，關于中醫(yī)藥治療肝炎的研究越來越多57，同時有研究說明：病毒性肝炎的發(fā)病機制與肝細胞凋亡親密相關，對肝細胞凋亡在病毒感染時肝臟病理生理變化過程中的地位,有人認為,首先肝內(nèi)浸潤的TL識別被HBV感染的肝細胞,并誘導其凋亡;其次,由活化的TL產(chǎn)生干擾素等使巨噬細胞在部分組織聚集,并吞噬凋亡細胞;然后干擾素、活化巨噬細胞及其產(chǎn)生的細胞因子(如TNF-等)引起部分炎癥和微循環(huán)障礙,進一步導致肝細胞廣泛壞死。這種假設合理解釋了肝細胞凋亡和肝臟炎癥反響之間的關

10、系及兩者在肝炎病理變化中的作用,并得到動物實驗的支持。凋亡失調在許多肝病的病理過程中起關鍵作用，凋亡增強可促進肝細胞死亡而致肝病，藥物抑制凋亡可能減輕肝損害和促進組織再生，因此，有關中藥或其有效成分對肝細胞凋亡影響的研究也逐漸增多8，9，如王福永等10發(fā)現(xiàn)丹參有抑制大鼠缺血-再灌注肝細胞凋亡作用，譚春雨等11發(fā)現(xiàn)扶正化淤方對DN肝纖維化大鼠肝細胞有保護作用，可促進受損傷肝細胞的修復,減少肝細胞凋亡。雖然這些研究還有待于進一步深化，但它們?yōu)橹嗅t(yī)藥治療乙肝的研究提供了新的方法和思路。本實驗擬通過白芍總苷和當歸提取物合用對肝細胞凋亡保護作用的初步研究，可為下一步中藥治療肝炎的開發(fā)研究提供借鑒?！緟⒖?/p>

11、文獻】1PatelT,GresGJ.ApptsisandhepatbiliarydiseaseJ.Hepatlgy,1995;21:1725.2LeastersJJ.TheithndrialpereabilitytransitinfrbiheialurisitytpathphysilgialehanisJ.Gastrenterlgy,1998,115,783.3姜泊,張亞歷,周殿文.分子生物學常用實驗方法.北京:人民軍醫(yī)出版社,1996:177.4劉鼎新,呂證寶.細胞生物學研究方法與技術.北京:北京醫(yī)科大學中國協(xié)和醫(yī)科大學結合出版社,1990:140.5周清榮，張園海，申悅平苦參素治療慢性乙型肝炎32例J.中西醫(yī)結合肝病雜志，2022，13350.6李季惠疏肝健脾方治療慢性乙型肝炎臨床觀察J.北京中醫(yī),2001，20(4):7.7樂恩施，邊壯清熱利濕法在慢性乙型肝炎中的治療作用J.天津中醫(yī)，2002，19124.8胡聰，胡彬.中藥復方及有效成分對肝細