實(shí)驗(yàn)操作指導(dǎo)書：豬胰蛋白酶的純化及其活性測(cè)定

1、PAGE PAGE 248 實(shí)驗(yàn)十 豬胰蛋白酶的純化及其活性測(cè)定一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?1. 學(xué)習(xí)胰蛋白酶的純化及其結(jié)晶的基本方法。 2. 學(xué)習(xí)用紫外法測(cè)定酶活性，搞清酶活性與比活性的概念。二、實(shí)驗(yàn)原理 胰蛋白酶是以無(wú)活性的酶原形式存在于動(dòng)物胰臟中，在Ca2+的存在下，被腸激酶或有活性的胰蛋白酶自身激活，從肽鏈N端 賴氨酸和異亮氨酸殘基之間的肽鍵斷開(kāi)，失去一段六肽，分子構(gòu)象發(fā)生一定改變后轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌浮?胰蛋白酶原的分子量約為24000，其等電點(diǎn)約為pH8.9，胰蛋白酶的分子量與其酶原接近（23300），其等電點(diǎn)約為pH10.8，最適pH7.68.0，在pH=3時(shí)最穩(wěn)定，低于此pH時(shí)，胰蛋白酶易

2、變性，在pH5時(shí)易自溶。Ca2+離子對(duì)胰蛋白酶有穩(wěn)定作用。 重金屬離子，有機(jī)磷化合物和反應(yīng)物都能抑制胰蛋白酶的活性，胰臟、卵清和豆類植物的種子中都存在著蛋白酶抑制劑。最近發(fā)現(xiàn)在一些植物的塊基（如土豆、白薯、芋頭等）中也存在有胰蛋白酶抑制劑。 胰蛋白酶能催化蛋白質(zhì)的水解，對(duì)于由堿性氨基酸（精氨酸、賴氨酸）的羧基與其他氨基酸的氨基所形成的鍵具有高度的專一性。此外還能催化由堿性氨基酸和羧基形成的酰胺鍵或酯鍵，其高度專一性仍表現(xiàn)為對(duì)堿性氨基酸一端的選擇。胰蛋白酶對(duì)這些鍵的敏感性次序?yàn)椋乎ユI 酰胺鍵 肽鍵。因此可利用含有這些鍵的酰胺或酯類化合物作為底物來(lái)測(cè)定胰蛋白酶的活力。目前常用苯甲酰-L-精氨酸-對(duì)

3、硝基苯胺（簡(jiǎn)稱BAPA）和苯甲酰-L-精氨酸-萘酰胺（簡(jiǎn)稱BANA）測(cè)定酰胺酶活力。用苯甲酰-L-精氨酸乙酯（簡(jiǎn)稱BAEE）和對(duì)甲苯磺酰-L-精氨酸甲酯（簡(jiǎn)稱TAME）測(cè)定酯酶活力。本實(shí)驗(yàn)以BAEE為底物，用紫外吸收法測(cè)定胰蛋白酶活力。酶活力單位的規(guī)定常因底物及測(cè)定方法而異。從動(dòng)物胰臟中提取胰蛋白酶時(shí)，一般是用稀酸溶液將胰腺細(xì)胞中含有的酶原提取出來(lái)，然后再根據(jù)等電點(diǎn)沉淀的原理，調(diào)節(jié)pH以沉淀除去大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質(zhì)，再以硫酸銨分級(jí)鹽析將胰蛋白酶原等（包括大量的酸性雜蛋白以及非蛋白雜質(zhì)，再以硫酸銨分級(jí)鹽析將胰蛋白酶原等（包括大量糜蛋白酶原和彈性蛋白酶原）沉淀析出。經(jīng)溶解后，以極少量活性

4、胰蛋白酶激活，使其酶原轉(zhuǎn)變?yōu)橛谢钚缘囊鹊鞍酌福拥鞍酌负蛷椥缘鞍酌竿瑫r(shí)也被激活），被激活的酶溶液再以鹽析分級(jí)的方法除去糜蛋白酶及彈性蛋白酶等組分。收集含胰蛋白酶的級(jí)分，并用結(jié)晶法進(jìn)一步分離純化。一般經(jīng)過(guò)23次結(jié)晶后，可獲得相當(dāng)純的胰蛋白酶，其比活力可達(dá)到800010000BAEE單位/毫克蛋白，或更高。 如需制備更純的制劑，可用上述酶溶液通過(guò)親和層析方法純化。三、器材與試劑（一）器材1. 新鮮或冰凍豬胰臟 2. 食品加工機(jī)和高速分散器3. 研缽 4. 大玻璃漏斗5. 小塑料桶 6. 布氏漏斗7. 抽濾瓶 8. 紗布9. 恒溫水浴 10. 紫外分光光度計(jì)11. 秒表 12. pH試紙（二）試劑1

5、. pH44.5乙酸酸化水 2. 2.5M H2SO43. 5M NaOH 4. 硫酸銨5. 氯化鈣 6. 2M NaOH 7. 0.8M，pH9.0硼酸緩沖液：取20ml 0.8M硼酸溶液，加80ml 0.2M四硼酸鈉溶液，混合后，用pH計(jì)檢查校正。 8. 0.4M pH9.0硼酸緩沖液（用“7”稀釋1倍即可） 9. 0.2M pH8.0硼酸緩沖液：取70ml 0.2M硼酸溶液，加30ml 0.5M四硼酸鈉溶液，混合后，用pH計(jì)校正。 10. 2M HCl 11. 0.01M HCl 12. BAEE0.15M pH8.0TrisHCl 緩沖液（每毫升Tris緩沖液含0.11毫克BAEE和2

6、.22毫克的氯化鈣）四、實(shí)驗(yàn)步驟 1. 豬胰蛋白酶結(jié)晶步驟 豬胰臟1.0公斤（新鮮的或殺后立即冷藏的），除去脂肪和結(jié)締組織后，絞碎，加入2倍體積予冷的乙酸酸化水（pH4.04.5）于1015攪拌提取24小時(shí)，四層紗布過(guò)濾得乳白色濾液，用2.5M H2SO4調(diào)pH至2.53.0，放置34小時(shí)后用折迭濾紙過(guò)濾得黃色透明濾液（約1.5升），加入固體硫酸銨（予先研細(xì)），使溶液達(dá)0.75飽和度（每升濾液加492克）放置過(guò)夜后抽濾（擠壓干），濾餅分次加入10倍體積（按餅重計(jì)）冷的蒸餾水，使濾餅溶解，得胰蛋白酶原溶液，取樣0.5ml后進(jìn)行活化：慢慢加入研細(xì)的固體無(wú)水氯化鈣（濾餅中硫酸銨的含量按餅重的四分之一

7、計(jì)）使Ca2+與SO42-結(jié)合后，溶液中仍含有0.1M CaCl2，邊加邊攪拌，用5M NaOH調(diào)pH至8.0，加入極少量豬胰蛋白酶輕輕攪拌，于室溫下 活化810小時(shí)，（23小時(shí)取樣一次，并用0.001M HCl稀釋），測(cè)定酶活性增加的情況?；罨瓿桑ū然罴s35004000BAEE單位）后，用2.5M H2SO4調(diào)pH至2.53.0，抽濾除去CaSO4沉淀，棄去濾餅，濾液取樣測(cè)定胰蛋白酶活性及蛋白質(zhì)含量，按242克/升 加入細(xì)粉狀固體硫酸銨，使溶液達(dá)到0.4飽和度，放置數(shù)小時(shí)后，抽濾，棄去濾餅，濾液按250克/升 加入研細(xì)的硫酸銨，使溶液飽度達(dá)到0.75，放置數(shù)小時(shí)，抽濾，棄去濾液，濾餅（粗胰

8、蛋白酶）溶解后進(jìn)行結(jié)晶：按每克濾餅溶于1.0ml pH9.0 的0.4M硼酸緩沖液的量計(jì)加入緩沖液，小心攪拌溶解，取樣后，用2M NaOH調(diào)pH至8.0，注意要小心調(diào)節(jié)，偏酸不易結(jié)晶，偏堿易失活，存放于冰箱。 放置數(shù)小時(shí)后，應(yīng)出現(xiàn)大量絮狀物，溶液逐漸變稠呈膠態(tài)，再加入總體積的1/41/5的pH8.0的0.2M硼酸緩沖液，使膠態(tài)分散，必要時(shí)加入少許胰蛋白酶晶體。 放置25天可得到大量胰蛋白酶結(jié)晶，每天觀察，核對(duì)pH是否為8.0并及時(shí)調(diào)整。用顯微鏡觀察，待結(jié)晶析出完全時(shí)，抽濾，母液回收，一次結(jié)晶的胰蛋白酶產(chǎn)物再進(jìn)行重結(jié)晶：用約1倍的0.025M HCl，使上述結(jié)晶分散，加入約1.01.5倍體積的p

9、H9.0 的0.8M硼酸緩沖液，至結(jié)晶酶全部溶解，取樣后，用2M NaOH調(diào)溶液pH至8.0（準(zhǔn)確）（體積過(guò)大，很難結(jié)晶），冰箱放置12天，可將大量結(jié)晶抽濾得第二次結(jié)晶產(chǎn)物(母液回收)，冰凍干燥后得重結(jié)晶的豬胰蛋白酶。 2. 胰蛋白酶活性的測(cè)定 紫外法測(cè)定酶溶液的蛋白質(zhì)含量 在280nm測(cè)得蛋白質(zhì)溶液的吸光度，除以該蛋白質(zhì)的比消光系數(shù)，即可算出該蛋白質(zhì)溶液的濃度（mg/ml）。 少量氯化鈉、硫酸銨、磷酸鹽、硼酸鹽和Tris等無(wú)明顯干擾作用。紫外法操作簡(jiǎn)便、快速，適合于制備過(guò)程中進(jìn)行監(jiān)測(cè)。 測(cè)定時(shí)將待測(cè)酶液用0.001M HCl稀至適當(dāng)濃度，以0.001M HCl作對(duì)照。豬胰蛋白酶在280nm的

10、比消光系數(shù)為：E1% 1cm=13.5 ，所以當(dāng)其濃度為1mg/ml時(shí)，消光系數(shù)應(yīng)為1.35。 胰蛋白酶的蛋白含量(mg/ml) A280稀釋倍數(shù)/1.35 胰蛋白酶活力的測(cè)定（BAEE法）：參見(jiàn)親和層析實(shí)驗(yàn)。五、注意事項(xiàng) 1. 胰臟必需是剛屠宰的新鮮組織或立即低溫存放的，否則可能因組織自溶而導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)失敗。 2. 在室溫1420條件下812小時(shí)可激活完全，激活時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，因酶本身自溶而會(huì)使比活降低， 比活性達(dá)到“30004000BAEE單位/mg蛋白” 時(shí)即可停止激活。 3. 要想獲得胰蛋白酶結(jié)晶，在進(jìn)行結(jié)晶時(shí)應(yīng)十分細(xì)心地按規(guī)定條件操作，切勿粗心大意，前幾步的分離純化效果愈好，則培養(yǎng)結(jié)晶也較容易，因