生物技術(shù)前沿進展之二RTPCR

1、TaqMan REAL-TIME PCR什么是Real Time PCR?實時監(jiān)控特定核酸目標序列PCR擴增的技術(shù)Technology to monitor, in real-time, the PCR amplification of specific nucleic acid targets Real Time PCR是如何實現(xiàn)的?在PCR混合液中含有熒光物質(zhì)（fluorescence）Real Time PCR是如何實現(xiàn)的?隨著擴增的進行, 熒光信號會隨著PCR產(chǎn)物的增加而增加PCRPCRLots of PCRPCR productReal Time PCR是如何實現(xiàn)的?Real-tim

2、e PCR儀會紀錄每個循環(huán)的熒光信號變化Cycle 3Filter ASample 1Bin NReal Time PCR是如何實現(xiàn)的?最后，Real Time軟件會對采集到的數(shù)據(jù)進行分析Real Time PCR化學原理熒光信號是怎樣隨著PCR產(chǎn)物的增加而增加的呢？ SYBR Green ITaqManTaqMan 化學原理 (又稱 5-Nuclease )TaqMan 化學原理TaqMan 中會使用到兩段短片段序列，稱為雙向特異引物TaqMan 化學原理TaqMan 中第三段短片段序列稱為探針，結(jié)合到序列中間TaqMan 化學原理探針標記兩種 染料分子報告染料Reporter dye淬滅染

3、料Quencher dyeTaqMan 化學原理完整的探針報告染料Reporter dye淬滅染料Quencher dyeTaqMan 化學原理完整的探針光 (激發(fā))能量報告染料Reporter沒有熒光信號TaqMan 化學原理如果探針斷裂了光 (激發(fā))TaqMan 放映開始TaqMan 化學原理Denaturating of template（模板變性）TaqMan 化學原理Annealing of oligos（引物退火）TaqMan 化學原理Taq酶 登場TaqMan 化學原理找到引物序列TaqMan 化學原理Extension of primers（序列延伸）TaqMan 化學原理Ex

4、tension of primers（序列延伸）TaqMan 化學原理Extension of primers（序列延伸）TaqMan 化學原理Extension of primers（序列延伸）TaqMan 化學原理Extension of primers（序列延伸）TaqMan 化學原理Extension of primers（序列延伸）?TaqMan 化學原理Taq酶 很特別具有核酸外切酶活性，可以“吃掉”結(jié)合到模板上的DNA片段TaqMan 化學原理Taq酶 開始降解探針TaqMan 化學原理Taq酶 開始降解探針TaqMan 化學原理Taq酶 開始降解探針TaqMan 化學原理Taq

5、酶 開始降解探針TaqMan 化學原理Taq酶 開始降解探針TaqMan 化學原理Taq酶 開始降解探針TaqMan 化學原理Taq酶 開始降解探針TaqMan 化學原理Taq酶 開始降解探針TaqMan 化學原理Taq酶 開始降解探針TaqMan 化學原理Taq酶 開始降解探針TaqMan 化學原理Taq酶 開始降解探針TaqMan 化學原理Taq酶 開始降解探針TaqMan 化學原理Taq酶 開始降解探針TaqMan 化學原理Taq酶 開始降解探針TaqMan 化學原理Taq酶 開始降解探針TaqMan 化學原理Taq酶 開始降解探針TaqMan 化學原理Taq酶 開始降解探針嗝!TaqM

6、an 化學原理新的序列，新的信號！SYBR Green I 化學原理SYBR Green I 化學原理SYBR Green I 化學原理SYBR Green I 化學原理新的序列，新的信號！SYBR Green I 化學原理非特異結(jié)合任意 雙鏈DNA定量結(jié)果不準確可能產(chǎn)生非特異性PCR產(chǎn)物信號SYBR Green I 化學原理使用 Melt curve (Dissociation Curve) 檢查PCR反應產(chǎn)物的特異性Temperature Fluorescence 原始圖譜SYBR Green I 化學原理使用 Melt curve (Dissociation Curve) 檢查PCR反應

7、產(chǎn)物的特異性Temperature Fluorescence 導數(shù)圖譜Real Time PCR化學原理每個循環(huán)之后理論上，反應管里的目標片斷數(shù)會加倍。熒光信號相應成比例增長。Real Time PCR化學原理TaqMan, 還是 . . . SYBR Green I ?優(yōu)點更高的特異性 不會有引物二聚體干擾支持多重熒光實驗設計實驗方法易于優(yōu)化缺點 價格稍貴優(yōu)點價格便宜大部分基因以及少量樣品均適用缺點特異性稍差必須要做 Melt curves 不支持多重熒光設計實驗方法通常需要優(yōu)化Real Time PCR實際狀態(tài)線形圖譜Linear 半對數(shù)圖譜LogReal Time PCR常用術(shù)語Base

8、line 基線定義背景區(qū)域: cycle-to-cycle 的范圍Baseline 基線的設置通?；€起點為 Cycle 3 Baseline 基線的設置通?；€終點設置在實驗信號脫離噪音信號上升前Baseline 基線的設置軟件自動設置基線軟件自動為您選定基線區(qū)域Baseline 基線的設置軟件自動設置基線每個樣品單獨設置基線。 可以使每個樣品擁有 “完美” 基線?？梢哉疹櫟郊扔懈邼舛葮悠芬灿械蜐舛葮悠返膶嶒?。Real Time PCR常用術(shù)語Threshold 閾值在擴增曲線上，可以調(diào)節(jié)的一條水平線告訴軟件到哪里獲得分析數(shù)據(jù) ThresholdThreshold 閾值的設置最佳位置: Xn = X0 2n 成立（指數(shù)/對數(shù)擴增期）Threshold 閾值的設置軟件自動設定閾值Threshold 閾值的設置軟件自動設定閾值對于不同的批次的實驗，需要單獨設置閾值因為不同批次的實驗，會有不同的指數(shù)/對數(shù)擴增期Real Time PCR常用術(shù)語Cycle threshold （又稱 Ct值）擴增曲線與閾值的焦點，對應的帶小數(shù)點的循環(huán)數(shù)This curve crosses the threshold at cycle 23.1Ct值的獲得自動分析手動分析基線決定閾值閾值決定Ct值Ct值的獲得基線決定閾值Linear圖