實(shí)驗(yàn)2培養(yǎng)基的配制、消毒與滅菌

1、實(shí)驗(yàn)二 培養(yǎng)基的制備 消毒與滅菌培養(yǎng)基配制實(shí)驗(yàn)原理培養(yǎng)基是人工配制的適合微生物生長(zhǎng)繁殖或積累代謝產(chǎn)物的營(yíng)養(yǎng)基質(zhì),用以培養(yǎng)、分離、鑒定、保存各種微生物或積累代謝產(chǎn)物。人工制備培養(yǎng)基的目的，在于給微生物創(chuàng)造一個(gè)合適的營(yíng)養(yǎng)條件。培養(yǎng)基配制要素營(yíng)養(yǎng)：水分、碳源、氮源、生長(zhǎng)因子和無(wú)機(jī)鹽；適宜的酸堿度(pH值)和一定緩沖能力；水活度；氧化還原電位。培養(yǎng)基的分類根據(jù)微生物的種類和實(shí)驗(yàn)?zāi)康牡牟煌?，培養(yǎng)基分類可以按以下方式：1. 按成分的不同分2. 按培養(yǎng)基的物理狀態(tài)分3. 按培養(yǎng)基的用途分按照培養(yǎng)基的成分來(lái)分天然培養(yǎng)基:主要成分是復(fù)雜的天然有機(jī)物質(zhì)：如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基、麥芽汁培養(yǎng)基、肉湯培養(yǎng)基等。合成培養(yǎng)基

2、:用化學(xué)成分完全了解的純化合物藥品配制而成的培養(yǎng)基：高氏一號(hào)培養(yǎng)基和査氏培養(yǎng)基等。半合成培養(yǎng)基：玉米培養(yǎng)基、豆芽汁培養(yǎng)基、馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基按照培養(yǎng)基的物理狀態(tài)固體培養(yǎng)基：加入凝固劑，如1.5% 2.5%瓊脂(m/v)半固體培養(yǎng)基：加入少量凝固劑，如 0.2% 0.7%瓊脂液體培養(yǎng)基：不含任何凝固劑按照培養(yǎng)基的用途分基礎(chǔ)培養(yǎng)基：如牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基（加富培養(yǎng)基）：如添加血清、血液等。鑒別培養(yǎng)基：用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入某種特殊的化學(xué)物質(zhì)，有些微生物在鑒別培養(yǎng)基上生長(zhǎng)，會(huì)產(chǎn)生的一些代謝產(chǎn)物，能與這種化學(xué)物質(zhì)反應(yīng)，發(fā)生明顯的特征性變化，根據(jù)這一變化，將這種微生物與

3、其它微生物區(qū)分開來(lái)。如伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基。伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基用于腸道菌群的分離鑒定。蛋白胨提供氮源、維生素和氨基酸乳糖為可發(fā)酵糖類伊紅 Y 和美藍(lán)抑制絕大部分革蘭氏陽(yáng)性菌的生長(zhǎng)瓊脂是凝固劑。大腸桿菌在 EMB 上發(fā)酵乳糖，形成有金屬光澤的紫黑色菌落。沙門氏菌形成無(wú)色或淺藍(lán)色菌落。金黃色葡萄球菌基本上不生長(zhǎng)。 按照培養(yǎng)基的用途分選擇培養(yǎng)基：利用微生物對(duì)某種化學(xué)物質(zhì)的敏感性不同，在培養(yǎng)基中加入這類物質(zhì)，抑制雜菌的生長(zhǎng)，而所需分離的微生物可以在培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，從而達(dá)到分離或鑒別某種微生物的目的。選擇培養(yǎng)基如鏈霉素、氯霉素等抑制原核微生物的生長(zhǎng)；而制霉菌素、灰黃霉素等能抑制真核微生物的生長(zhǎng)；結(jié)晶紫能抑制革蘭氏陽(yáng)

4、性細(xì)菌的生長(zhǎng)加富培養(yǎng)基：在普通培養(yǎng)基中加入特別適合某種微生物生長(zhǎng)的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，以增加這種微生物的繁殖速度，使其形成生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，逐漸淘汰其它微生物，從而分離到該種微生物；從某種意義，加富培養(yǎng)基也是一種選擇培養(yǎng)基。加富培養(yǎng)基P241附錄II牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基的制備應(yīng)用最廣泛的細(xì)菌基礎(chǔ)培養(yǎng)基牛肉膏： 3 g蛋白胨： 10 gNaCl： 5 g瓊脂： 15-20 g水： 1000 mLpH： 7.47.6馬鈴薯培養(yǎng)基（PDA）的制備用來(lái)培養(yǎng)真菌馬鈴薯： 200 g蔗糖（葡萄糖） 20 g瓊脂： 15-20 g水： 1000 mLpH： 自然馬鈴薯去皮，切成塊煮沸30分鐘，然后用紗布過(guò)濾；濾液中加入糖和瓊脂

5、，溶化后補(bǔ)足水至1000 mL。高氏號(hào)培養(yǎng)基的制備用來(lái)培養(yǎng)放線菌可溶性淀粉： 20 gKNO3： 1 gNaCl： 0.5 gK2HPO43H2O： 0.5 g MgSO47H2O： 0.5 g FeSO47H2O： 0.01 g瓊脂： 20 g水： 1000 mLpH： 7.27.4無(wú)氮培養(yǎng)基的制備用來(lái)培養(yǎng)固氮菌葡萄糖： 10 gKH2PO4： 0.2 g MgSO47H2O： 0.2 g NaCl： 0.2 gCaSO42H2O： 0.2 gCaCO3： 5 g瓊脂： 20 g水： 1000 mLpH： 7.07.2豆芽汁培養(yǎng)基的制備用來(lái)培養(yǎng)酵母菌黃豆芽： 100 g蔗糖（葡萄糖）： 50

6、 g瓊脂： 20 g水： 1000 mLpH： 自然稱取新鮮黃豆芽100 g，放入燒杯中加水煮沸約30 min，用紗布過(guò)濾。濾液中加入糖和瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至1000 mL，最后滅菌。麥?zhǔn)希∕eclary）培養(yǎng)基的制備用來(lái)培養(yǎng)酵母菌，利于釀酒酵母子囊孢子的形成葡萄糖： 1 gKCl： 1.8 g酵母浸膏： 2. 5 g 醋酸鈉： 8.2 g 瓊脂： 20 g水： 1000 mLpH： 自然玉米粒培養(yǎng)基（5406培養(yǎng)基）用來(lái)培養(yǎng)放線菌，觀察孢子形成玉米粒： 50 g葡萄糖： 20 g碳酸鈣： 2 g 酵母膏： 1 g 瓊脂： 20 g牛肉膏： 2 g水： 1000 mL稱取玉米粒50 g，加水煮

7、沸約30 min。加入其余成分和瓊脂，溶化后補(bǔ)足水至1000 mL，最后滅菌。操作步驟稱量溶化補(bǔ)足水分，調(diào)pH（過(guò)濾）分裝6. 加塞7. 包扎8. 滅菌9. 擱置斜面10. 無(wú)菌檢查稱量藥品時(shí)，嚴(yán)防藥品混雜。稱完一種藥品后需要將牛角匙洗凈、擦干，再稱取另一藥品。瓶蓋也不要蓋錯(cuò)。藥品不要弄錯(cuò)。如：K2HPO4和KH2PO4、水合形式和無(wú)水形式的化合物要注意分辨。培養(yǎng)基中多種無(wú)機(jī)鹽可能相互作用而產(chǎn)生沉淀。因此，在混合培養(yǎng)基成分時(shí)，一般是按配方的順序依次溶解各成分，甚至有時(shí)還需要將二種或多種成分分別滅菌，使用時(shí)再按比例混合。對(duì)于微量成分，可先配制成高濃度的儲(chǔ)備液，按比例換算后再加入。瓊脂溶化過(guò)程中，

8、要控制火力并不斷攪拌，以免沸騰溢出或瓊脂糊底燒焦。不可用銅或鐵鍋加熱溶化，以免離子進(jìn)入培養(yǎng)基。調(diào)pH值以前，先補(bǔ)足水分。pH值不要調(diào)過(guò)頭，以免回調(diào)影響個(gè)離子濃度。固體分裝：不超過(guò)試管高度的1/5；不超過(guò)三角燒瓶容積的一半為宜。分裝過(guò)程中，注意不要使培養(yǎng)基沾在管（瓶）口上以免污染棉塞而引起污染。配好培養(yǎng)基后要貼上標(biāo)簽，寫清培養(yǎng)基類型、組別、配制時(shí)間。培養(yǎng)基滅菌在微生物實(shí)驗(yàn)中，需要進(jìn)行純培養(yǎng)，不能有任何雜菌污染，因此對(duì)所用器材、培養(yǎng)基和工作場(chǎng)所都要進(jìn)行嚴(yán)格的消毒和滅菌。配制培養(yǎng)基所用的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、容器、環(huán)境中都含有各種微生物；微生物生長(zhǎng)繁殖： 消耗養(yǎng)分 改變培養(yǎng)的酸堿度 產(chǎn)生毒素或者抑制物消毒與滅菌

9、消毒是一般指采用物理、化學(xué)和生物的方法消滅病原菌和有害微生物的營(yíng)養(yǎng)體。滅菌則是殺滅一切微生物的營(yíng)養(yǎng)體、芽孢和孢子的過(guò)程。消毒與滅菌方法加熱滅菌干熱滅菌濕熱滅菌過(guò)濾除菌輻射滅菌放射線輻照滅菌紫外線滅菌干熱滅菌干熱滅菌是利用高溫使微生物細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌的目的。干熱滅菌有火焰灼燒滅菌、熱空氣滅菌以及電熱滅菌。細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的凝固性與其含水量有關(guān)。在菌體受熱時(shí)，當(dāng)環(huán)境和細(xì)胞內(nèi)含水量越大，則蛋白蛋凝固就越快，反之凝固緩慢。因此，與濕熱滅菌相比，干熱滅菌所需溫度要高（160170），時(shí)間要長(zhǎng)（12h），但干熱滅菌溫度不能超過(guò)180，否則，包器皿的紙或棉塞就會(huì)燒焦，甚至引起燃燒。高壓蒸氣滅菌高

10、壓蒸氣滅菌是將待滅菌的物品放在一個(gè)密閉的滅菌鍋內(nèi)，通過(guò)加熱，使滅菌鍋隔套間的水沸騰而產(chǎn)生蒸汽（0.05MPa）。排出滅菌鍋中的冷空氣，關(guān)閉排氣閥，繼續(xù)加熱。由于水蒸氣集聚，增加了滅菌鍋內(nèi)的壓力（0.1MPa），從而使水的沸點(diǎn)增高，得到高于100的溫度。導(dǎo)致菌體蛋白質(zhì)凝固變性而達(dá)到滅菌目的。高壓蒸氣滅菌一般培養(yǎng)基在0.1 MPa下，121維持1530 min可達(dá)到徹底滅菌的目的。滅菌的溫度及維持的時(shí)間隨滅菌物品的性質(zhì)和容量等具體情況而有所改變。其原因有三： 一、濕熱中細(xì)菌菌體吸收水分，蛋白質(zhì)較易凝固； 二、濕熱的穿透力比干熱大； 三、濕熱的蒸氣有潛熱存在。 1 g水在100時(shí)，由氣態(tài)變?yōu)橐簯B(tài)時(shí)可

11、放出2.26 kJ(千焦)的熱量。這種潛熱，能迅速提高被滅菌物體的溫度，從而增加滅菌效力。在同一溫度下，濕熱的殺菌效力比干熱大。在使用高壓蒸氣滅菌鍋滅菌時(shí)，滅菌鍋內(nèi)冷空氣的排除是否完全極為重要，因?yàn)榭諝獾呐蛎泬捍笥谒魵獾呐蛎泬?，所以，在同一壓力下，含空氣蒸氣的溫度低于飽和蒸氣的溫度。注意事?xiàng)注意事項(xiàng)當(dāng)含鹽類的液體和含鹽的瓊脂中大量的鹽類潑灑在工作腔體，要立即換水，沖洗腔體。否則它們會(huì)帶來(lái)腐蝕和變質(zhì)。滅菌結(jié)束時(shí)，要檢查壓力表上的指數(shù)為“0 Mpa”后才能打開鍋蓋。待滅物體不能堵塞通風(fēng)孔，否則會(huì)引起裝置故障，甚至爆炸。過(guò)濾除菌過(guò)濾除菌是通過(guò)機(jī)械作用濾去液體中微生物的方法。根據(jù)不同的需要選用不同的

12、濾器和濾板材料。過(guò)濾除菌的最大優(yōu)點(diǎn)是可以不破壞溶液中各種物質(zhì)的化學(xué)成分，但由于濾量有限，所以一般只適用于實(shí)驗(yàn)室中小量溶液的過(guò)濾除菌。紫外線滅菌紫外線滅菌是用紫外燈為光源。波長(zhǎng)為200300 nm的紫外線都有殺菌能力，其中以260nm的殺菌力最強(qiáng)。在波長(zhǎng)一定的條件下，紫外線的殺菌效率與強(qiáng)度和時(shí)間的乘積成正比。紫外線殺菌機(jī)理主要是因?yàn)樗T導(dǎo)了胸腺嘧啶二聚體的形成和DNA鏈的交聯(lián)，從而抑制了DNA的復(fù)制。另一方面，由于輻射能使空氣中的氧電離成O，再使O2氧化生成臭氧（O3）或使水（H2O）氧化生成過(guò)氧化氫（H2O2）。O3和H2O2均有殺菌作用。紫外線穿透力弱，所以，只適用于無(wú)菌室，接種箱，手術(shù)室內(nèi)的空氣及物體表面的滅菌。為了加強(qiáng)紫外線滅菌效果，在打開紫外燈前，可在無(wú)菌室內(nèi)(或接種箱內(nèi))噴灑3%5%石炭酸溶液，一方面使空氣中附著有微生物的塵埃降落，另一方面也可以殺死一部分細(xì)菌；在無(wú)菌室內(nèi)的桌面