免疫自動(dòng)化儀器分析

1、免疫自動(dòng)化儀器分析第1頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一概論早期免疫分析通過觀察沉淀物形成，凝集及溶血現(xiàn)象發(fā)生來分析，如免疫擴(kuò)散、免疫電泳、血凝試驗(yàn)、補(bǔ)體結(jié)合等上世紀(jì)50年代末60年代初，利用AG-AB復(fù)合物形成使?jié)岫雀淖?，再用比濁?jì)來比濁，但因其敏感性差未被接受70年代初，開始有自動(dòng)檢測(cè)系統(tǒng)，但因其用的是激光為光源，固定波長，靈敏度較低，而且時(shí)間一般要23小時(shí)第2頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一概論70年代未，速率比濁計(jì)的出現(xiàn)，使抗原抗體結(jié)合的反應(yīng)在幾十秒內(nèi)出結(jié)果，可以說是免疫化學(xué)測(cè)定的革命的發(fā)展隨著標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展，免疫化學(xué)可以納入臨床化學(xué)檢驗(yàn)范

2、疇如今，自動(dòng)化免疫分析系統(tǒng)更加飛速發(fā)展自動(dòng)化免疫分析的基礎(chǔ)是抗原抗體的結(jié)合，具有高特異性；手段多是利用標(biāo)記技術(shù)而將檢測(cè)信號(hào)放大，具有高靈敏度第3頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一自動(dòng)化免疫儀器種類（應(yīng)用技術(shù)）免疫比濁分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光、電發(fā)光分析技術(shù)熒光免疫分析技術(shù)放射免疫分析技術(shù)酶免疫分析技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)第4頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一免疫比濁利用抗原抗體結(jié)合后溶液的濁度變化而檢測(cè)的一種方法此法準(zhǔn)確快速，已成為免疫診斷技術(shù)中重要的檢測(cè)手段比濁法與比色法第5頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一散射免疫比濁分析法 基本原理：抗原抗

3、體復(fù)合物對(duì)一定波長的光產(chǎn)生折射、偏轉(zhuǎn)，偏轉(zhuǎn)角度及散射光強(qiáng)度與復(fù)合物粒子的大小和量有關(guān)（圖）Rayleigh散射（圖） Mile散射Heidelberger曲線第6頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一定時(shí)散射比濁分析基本原理：免疫沉淀反應(yīng)和散射比濁分析結(jié)合之技術(shù)，反應(yīng)分兩個(gè)階段，預(yù)反應(yīng)階段和反應(yīng)階段（圖）保證抗原不過量的方法： 確保反應(yīng)體系抗體過量 對(duì)抗原過量進(jìn)行閾值限定第7頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一預(yù)反應(yīng)階段5ul樣本抗原過剩區(qū)閾值信號(hào)反 應(yīng) 階 段45ul樣本7.5秒2分鐘6分鐘（2+4分鐘）定時(shí)散射比濁反應(yīng)曲線圖抗原不過量抗原過量第8頁，共

4、55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一速率散射比濁分析基本原理：抗原抗體結(jié)合反應(yīng)的一種動(dòng)態(tài)測(cè)定法，適時(shí)檢測(cè)抗原抗體復(fù)合物形成的散射光信號(hào)最快反應(yīng)時(shí)間（圖）抗原過量檢測(cè)（圖）第9頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一抗原濃度遞增散射光峰值峰值信號(hào)與抗原抗體反應(yīng)之間的關(guān)系圖ABCDFGHI第10頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一反應(yīng)時(shí)間（秒）06085散射率抗體過量抗原過量第二峰值信號(hào)抗原量檢測(cè)速率峰值信號(hào)產(chǎn)生第11頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一免疫透射比濁基本原理：檢測(cè)信號(hào)是通過溶液的光，測(cè)量角度與正前方夾角為0（圖）

5、，保持抗體過量，形成可溶性AG-AB復(fù)合物，使介質(zhì)濁度發(fā)生改變。實(shí)驗(yàn)要求： 選擇親和力高的抗體，抗原抗體復(fù)合物要大、數(shù)量要多，反應(yīng)時(shí)間充分。第12頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一單色器透射比濁計(jì)散射比濁計(jì)散射比濁和透射比濁的區(qū)別示意圖透射光散射光散射光第13頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一膠乳濁度測(cè)定法基本原理是：將抗體吸附在大小適中、均勻一致的膠乳顆粒上，當(dāng)遇到相應(yīng)抗原時(shí)，則使膠乳顆粒發(fā)生凝集。單個(gè)膠乳顆粒在入射光波之內(nèi)不阻礙光線透過，兩個(gè)或兩個(gè)以上膠乳顆粒凝聚時(shí)則使透過光減少，這種減少的程度與膠乳顆粒凝聚的程度呈正比，當(dāng)然也與待測(cè)抗原量呈正比

6、（圖） 第14頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一光波膠乳濁度測(cè)定法原理dd 2d第15頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一影響免疫比濁的因素 抗原抗體比例抗體純度和效價(jià)增聚劑（PEG）第16頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一自動(dòng)免疫濁度分析儀的要求校準(zhǔn)程序，使儀器處于正常的工作狀態(tài)定標(biāo)程序，保證檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確性自動(dòng)控制，保證實(shí)施實(shí)驗(yàn)條件中的抗原抗體反應(yīng)體系要求自動(dòng)系統(tǒng)，障礙的檢測(cè)和預(yù)警。第17頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一自動(dòng)化免疫儀器種類（應(yīng)用技術(shù)）免疫比濁分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光、電發(fā)光分析技術(shù)熒光免疫分析技

7、術(shù)放射免疫分析技術(shù)酶免疫分析技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)第18頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一化學(xué)發(fā)光自動(dòng)免疫分析化學(xué)發(fā)光是指在化學(xué)反應(yīng)過程中產(chǎn)生光的發(fā)射現(xiàn)象基本原理：標(biāo)記在抗原或抗體上的發(fā)光物質(zhì)在堿性介質(zhì)中氧化時(shí)產(chǎn)生激發(fā)態(tài)的中間體，中間體回基態(tài)時(shí)產(chǎn)生輻射，多余的能量為發(fā)射光子，產(chǎn)生發(fā)光現(xiàn)象，再對(duì)光信號(hào)進(jìn)行接收轉(zhuǎn)化，可得檢測(cè)物濃度發(fā)光物質(zhì)須具備：氧化致發(fā)光、光量子產(chǎn)額高、理化性能好第19頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一化學(xué)發(fā)光自動(dòng)免疫分析類型 化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA） 是一種用發(fā)光劑直接標(biāo)記抗體的一類免疫分析法，用來標(biāo)記的發(fā)光物必須能參與發(fā)光反應(yīng)、標(biāo)記和偶

8、聯(lián)后能穩(wěn)定、理化性質(zhì)和免疫特性不改變，多用吖啶酯類和苯酚類化合物。 第20頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一化學(xué)發(fā)光自動(dòng)免疫分析類型化學(xué)發(fā)光酶免疫分析（CLEIA） 以催化反應(yīng)的酶為標(biāo)記物，抗原抗體結(jié)合后，其中的酶可對(duì)發(fā)光體系產(chǎn)生催化作用，產(chǎn)生發(fā)光效應(yīng)。發(fā)光信號(hào)與抗原抗體的量成正比。多用的發(fā)光體系是HRP-魯米諾。 第21頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一化學(xué)發(fā)光自動(dòng)免疫分析類型微粒子化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECIA） 也是一種酶免疫分析，用磁珠作為固相載體，增加反應(yīng)體積和分離效率。標(biāo)記的酶多為ALP。第22頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分

9、，星期一化學(xué)發(fā)光自動(dòng)免疫分析類型電化學(xué)發(fā)光免疫分析（ECLIA） 一種在電極表面由電化學(xué)引發(fā)的特異性化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，實(shí)際上包括了電化學(xué)和化學(xué)發(fā)光二個(gè)過程,其中應(yīng)用了“親和素-生物素”放大系統(tǒng)，使檢測(cè)的靈敏度大大提高以雙抗體夾心法為例之圖示（圖）第23頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一ECLIA體系結(jié)構(gòu)圖第24頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一ECLIA檢測(cè)流程圖一（雙抗體夾心的形成）第25頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一ECLIA檢測(cè)流程圖二 （生物素與親和素結(jié)合）第26頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一E

10、CLIA檢測(cè)流程圖三 （磁珠吸引吸附于電極表面）第27頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一ECLIA檢測(cè)流程圖四 （電極充電啟動(dòng)電化學(xué)反應(yīng)）第28頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一ECLIA檢測(cè)流程圖五 （撤消磁場(chǎng)沖洗磁珠）第29頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一化學(xué)發(fā)光自動(dòng)免疫分析化學(xué)發(fā)光免疫分析是免疫技術(shù)、發(fā)光技術(shù)和計(jì)算機(jī)系統(tǒng)的結(jié)合，具有特異性強(qiáng)、靈敏度高（pg/ml)、精密度好、準(zhǔn)確度好等特點(diǎn)，越來越多的人體微量指標(biāo)應(yīng)用這種方法來檢測(cè)，已漸漸代替了RIA。第30頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一自動(dòng)化免

11、疫儀器種類（應(yīng)用技術(shù)）免疫比濁分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光、電發(fā)光分析技術(shù)熒光免疫分析技術(shù)放射免疫分析技術(shù)酶免疫分析技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)第31頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一熒光免疫自動(dòng)化利用熒光物質(zhì)標(biāo)記抗原抗體的一種檢測(cè)方法由免疫反應(yīng)、熒光及計(jì)算機(jī)技術(shù)聯(lián)合應(yīng)用的技術(shù)主要有時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定和熒光偏振免疫測(cè)定第32頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一熒光免疫自動(dòng)化時(shí)間分辨熒光免疫測(cè)定（TRFIA）：AG-AB結(jié)合，某些熒光物質(zhì)發(fā)長壽命熒光，時(shí)間分辨技術(shù)利用長壽命熒光物質(zhì)（鑭氏元素銪螯合物）標(biāo)記抗原或抗體，測(cè)定過程中，可利用延遲時(shí)間來消除非特異性的熒光干擾（圖） 。第

12、33頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一光強(qiáng)度激發(fā)短壽命熒光長壽命熒光延遲時(shí)間測(cè)量時(shí)間銪螯合物的激發(fā)、發(fā)射光譜第34頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一熒光免疫自動(dòng)化TRFIA設(shè)計(jì)中的一些注意事項(xiàng)： Stakes位移（圖） 解離增強(qiáng)第35頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一熒光免疫自動(dòng)化熒光偏振免疫測(cè)定：以小分子物質(zhì)與大分子物質(zhì)的旋轉(zhuǎn)差異而使它們對(duì)偏振光的吸收不同為依據(jù)檢測(cè)小分子藥物熒光酶免疫分析：標(biāo)記酶參與反應(yīng)第36頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一波長300 400 500 600 700Stakes吸光度S

13、takes位移示意圖激發(fā)光熒光第37頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一自動(dòng)化免疫儀器種類（應(yīng)用技術(shù)）免疫比濁分析技術(shù)化學(xué)發(fā)光、電發(fā)光分析技術(shù)熒光免疫分析技術(shù)放射免疫分析技術(shù)酶免疫分析技術(shù)流式細(xì)胞術(shù)第38頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀（FCM）是以激光為光源，檢測(cè)生物學(xué)顆粒理化性質(zhì)的儀器生物學(xué)顆粒包括免疫復(fù)合物、DNA、RNA、蛋白質(zhì)、病毒顆粒、脂質(zhì)體、細(xì)胞器、細(xì)胞、染色體、真核細(xì)胞等理化性質(zhì)則為細(xì)胞大小、形狀、胞漿顆粒、DNA含量、酶活性等第39頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一流式細(xì)胞儀FCM綜合了激光

14、技術(shù)、電子技術(shù)、流體力學(xué)、細(xì)胞化學(xué)及計(jì)算機(jī)技術(shù)，被稱為實(shí)驗(yàn)室“CT”FCM現(xiàn)正廣泛應(yīng)用于細(xì)胞生物學(xué)、免疫學(xué)、腫瘤學(xué)、血液學(xué)、病理學(xué)、遺傳學(xué)、臨床檢驗(yàn)學(xué)等第40頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一流式細(xì)胞儀基本原理基本原理：單個(gè)經(jīng)熒光染料染色的細(xì)胞經(jīng)過激光激發(fā)后，發(fā)射的熒光在不同的角度進(jìn)行測(cè)量，并對(duì)其信號(hào)進(jìn)行綜合分析（圖）細(xì)胞分選原理：通過測(cè)量區(qū)的細(xì)胞若其參數(shù)符合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的條件，在經(jīng)過偏轉(zhuǎn)板時(shí)被充上相應(yīng)的電荷并被偏轉(zhuǎn)收集（圖）第41頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一第42頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一第43頁，共55頁，2022

15、年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一液流系統(tǒng)：樣本和鞘流液組成（圖）光學(xué)系統(tǒng)：光源可為汞燈或激光信號(hào)接收系統(tǒng)：散射光和熒光的檢測(cè)流式細(xì)胞儀基本組成第44頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一側(cè)向熒光信號(hào)鞘流前向散射光流式細(xì)胞流動(dòng)池示意圖噴嘴激光束第45頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一散射光的檢測(cè)信號(hào)的產(chǎn)生及強(qiáng)度（圖）前向散射光（圖）側(cè)向散射光（圖）第46頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一信號(hào)的產(chǎn)生激光照射區(qū)信號(hào)檢測(cè)曲線第47頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一細(xì)胞中熒光素今量與信號(hào)的關(guān)系信號(hào)的產(chǎn)生第48頁，共55

16、頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一細(xì)胞中熒光素今量與信號(hào)的關(guān)系信號(hào)的產(chǎn)生第49頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一激光器激光器激光探測(cè)器大顆粒小顆粒前散射光示意圖第50頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一激光器激光器側(cè)向散射光探測(cè)器復(fù)雜顆粒簡單顆粒側(cè)向散射光示意圖第51頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一熒光測(cè)量熒光染料染色的細(xì)胞通過測(cè)量區(qū)時(shí)，細(xì)胞中特異性熒光物質(zhì)受激發(fā)產(chǎn)生熒光信號(hào)，后者強(qiáng)弱表示待測(cè)物質(zhì)的多少熒光的檢測(cè)系統(tǒng)由濾光片和檢測(cè)器組成，濾光片的作用是使激發(fā)光波長盡可能接近熒光染料的激發(fā)光譜峰值，濾除非熒光信號(hào)，提高熒光的檢測(cè)強(qiáng)度第52頁，共55頁，2022年，5月20日，5點(diǎn)26分，星期一流式細(xì)胞儀免疫分析的技術(shù)要求儀器性能指標(biāo)：熒光分辨率、熒光靈敏度、前向角散色光靈敏度、前向角散光分辨率、分析/分選速度、分選純度、分選收獲率檢測(cè)樣品要求要單細(xì)胞懸液熒光標(biāo)記常用的染