2015年起-克隆產(chǎn)品齊學(xué)會(huì)系列1

1、姓名：齊學(xué)會(huì)日期：2016年7月克隆與點(diǎn)突變系列產(chǎn)品2上篇：克隆基礎(chǔ)原理下篇：克隆與點(diǎn)突變系列產(chǎn)品與競品比較培訓(xùn)內(nèi)容3上篇：克隆基礎(chǔ)原理什么是克隆什么是基因克隆基因克隆構(gòu)建流程基因克隆技術(shù)分類及原理4克隆克隆，是Clone 的譯音，意為無性繁殖。 英語Clone一詞起源于希臘文Klone，原意是用嫩枝或插條繁殖。 現(xiàn)在克隆的含義已不僅僅是簡單的無性繁殖，凡來自一個(gè)祖先，經(jīng)過無性繁殖出的一群個(gè)體，也叫克隆。這種來自一個(gè)祖先的無性繁殖的后代群體也叫無性繁殖系，簡稱無性系。在自然界，有不少植物具有先天的克隆本能，如番薯、馬鈴薯、玫瑰等插枝繁殖的植物。而動(dòng)物的克隆技術(shù)，則經(jīng)歷了由胚胎細(xì)胞到體細(xì)胞的發(fā)展

2、過程。5克隆6基因克隆基因克隆技術(shù)（Gene Cloning Techniques）或分子克隆，又稱為重組DNA技術(shù)，是應(yīng)用酶學(xué)方法，在體外將不同來源的DNA分子通過酶切、連接等操作重新組裝成雜合分子，并使之在適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增，形成大量的子代DNA分子的過程。 基因克?。╟lone）是指含有單一的DNA重組體的無性繁殖系，或指將DNA重組體引入宿主細(xì)胞建立無性繁殖系的過程。7基因克隆技術(shù)包括了一系列技術(shù)，它大約建立于70年代初期。這項(xiàng)革命性的研究技術(shù)，可概括為分、切、連、轉(zhuǎn)、選。 “分”分離制備合格的待操作的DNA，包括載體DNA和目的DNA；“切”用序列特異的限制性內(nèi)切酶切開載體DN

3、A和目的DNA；“連”用DNA連接酶將目的DNA同載體DNA連接，形成重組DNA分子；“轉(zhuǎn)”將重組的DNA分子送入宿主細(xì)胞中進(jìn)行復(fù)制和擴(kuò)增；“選”從宿主群體中挑選出攜帶有重組DNA分子的個(gè)體。 傳統(tǒng)的酶切連接基因克隆的發(fā)展8獲取目的基因選擇合適載體體外重組導(dǎo)入宿主細(xì)胞重組子篩選鑒定基因組文庫cDNA文庫人工合成PCR擴(kuò)增質(zhì)粒噬菌體其他病毒感受態(tài)細(xì)胞法細(xì)菌載體上的遺傳標(biāo)志菌落PCR酶切測序基因克隆的過程概述目的基因啟動(dòng)子復(fù)制原點(diǎn)終止子標(biāo)記基因9過程一、獲取目的基因目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。獲取目的基因的主要方法：用限制性內(nèi)切酶酶解染色體DNA，構(gòu)建基因組文庫，再從基因組文庫中篩

4、選目的基因。分離純化細(xì)胞中的mRNA，以mRNA為模板，反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，構(gòu)建cDNA文庫，從中篩選所需的目的基因。人工體外合成基因：僅用于制備小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。PCR法擴(kuò)增基因：PCR(聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)的出現(xiàn)和發(fā)展，為目的基因的尋找提供了有力技術(shù)工具。10過程二、選擇合適載體前述方法制備的目的基因如果沒有合適的載體協(xié)助，很難進(jìn)入受體細(xì)胞，且一般不帶有復(fù)制調(diào)控系統(tǒng)。為了保證目的基因或外源DNA片段能在細(xì)胞內(nèi)克隆，必須將它們與適當(dāng)?shù)妮d體連接。基因工程的載體應(yīng)具有一些基本的性質(zhì)：在宿主細(xì)胞中有獨(dú)立的復(fù)制和表達(dá)的能力分子量盡可能小載體分子中最好具有兩個(gè)以上的容易檢測的遺

5、傳標(biāo)記（如抗藥性標(biāo)記基因） 載體本身最好具有盡可能多的限制酶單一切點(diǎn)11DNA克隆常用的載體有：質(zhì)粒載體（plasmid）噬菌體載體（phage）柯斯質(zhì)載體（cosimid）單鏈DNA噬菌體載體（ssDNA phage ）噬粒載體（phagemid）酵母人工染色體（YAC）載體的分類（根據(jù)載體的使用目的）：克隆載體表達(dá)載體測序載體穿梭載體過程二、選擇合適載體12過程三、體外重組體外重組即體外將目的片斷和載體分子連接的過程。這種由兩種不同DNA片段重新組合而成的DNA稱重組DNA，簡稱重組體或重組子。目的基因TOPO克隆Gateway酶切連接同源重組TA克隆13過程四、導(dǎo)入宿主細(xì)胞載體DNA分子

6、上具有能被原核宿主細(xì)胞識(shí)別的復(fù)制起始位點(diǎn)，因此可以在原核細(xì)胞如大腸桿菌中復(fù)制，重組載體中的目的基因隨同載體一起被擴(kuò)增，最終獲得大量同一的重組DNA分子。14過程五、重組子篩選鑒定陽性重組體的篩選：可利用載體上的遺傳標(biāo)志，包括抗藥性(采用無抗藥性的受體菌)、氨基酸合成酸系(用缺該酶系的異養(yǎng)型受體菌)和顏色反應(yīng)(如互補(bǔ)效應(yīng))等。菌落雜交，將平皿上的轉(zhuǎn)化菌落轉(zhuǎn)印到硝酸纖維膜上，經(jīng)堿處理使DNA變性，然后用目的基因的標(biāo)記探針與之雜交，漂洗去多余的探針后進(jìn)行放射性自顯影，根據(jù)顯影片上的斑點(diǎn)可判斷含有目的基因的菌落。15重組DNA的鑒定：菌落PCR、限制性酶切圖譜、DNA測序，Southern印跡雜交等，

7、可根據(jù)情況酌情使用。過程五、重組子篩選鑒定16獲取目的基因選擇合適載體體外重組導(dǎo)入宿主細(xì)胞重組子篩選鑒定克隆流程再回顧17基因克隆質(zhì)粒水平基因構(gòu)建的載體蛋白分子生物學(xué)中的基本克隆技術(shù)用于表達(dá)或其他的定向克隆用于測序或其他的入門克隆用于修飾或其他的定點(diǎn)突變技術(shù)成熟，但是費(fèi)時(shí)，費(fèi)力；連接效率低，陽性率低；克隆位點(diǎn)易受限制。18定向克隆定向克隆同源重組傳統(tǒng)克隆酶切連接不依賴連接酶依賴連接酶19酶切連接消化載體 + 消化插入片段 = 連接PS:克隆位點(diǎn)不友好或缺少時(shí)，克隆難度再次加大！基因構(gòu)建的載體蛋白限制性內(nèi)切酶技術(shù)成熟，但是費(fèi)時(shí)，費(fèi)力；連接效率低，陽性率低；克隆位點(diǎn)易受限制。20酶切連接21案例

8、1: 較少的可用酶切位點(diǎn)酶切連接22案例 2: 單一的可用酶切位點(diǎn)高背景CIAP 酶雙向性酶切連接23案例 3: 無可用酶切位點(diǎn)酶切連接24多個(gè)基因多個(gè)構(gòu)建質(zhì)粒多個(gè)蛋白同一載體案例 4: 多個(gè)基因 + 同一載體酶切連接25ClonExpress讓克隆隨心所欲！基于同源重組的無縫克隆技術(shù)不依賴連接酶Exnase+ Exnase如果可識(shí)別，然后可重組。末端可識(shí)別26+ Exnase同一原理: 定向克隆 + 入門克隆 + 定點(diǎn)突變基于同源重組的無縫克隆技術(shù)不依賴連接酶Exnase末端可識(shí)別如果可識(shí)別，然后可重組。ClonExpress讓克隆隨心所欲！27ClonExpress II引物設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增

9、插入片段線性化載體重組反應(yīng)30 min轉(zhuǎn)化 僅需3.5小時(shí)Vazyme的ClonExpress IIClontech的In-Fusion專利酶10ul重組體系，15min 50含酶切位點(diǎn)在內(nèi)的15bp同源臂28Clontech的In-Fusion29Clontech的In-Fusion引物設(shè)計(jì)：5突出平端3突出30全式金的Uni Cloning31全式金的Uni Cloning引物設(shè)計(jì)：5突出平端3突出32NEB的Gibson Assembly33NEB的Gibson Assembly34NEB的NEBuilder HiFi DNA Assembly35入門克?。簩谢虿迦氲教囟ǖ妮d體，用于

10、測序或其他。TA CloningTOPO Blunt/TA CloningGateWay CloningPCR - (+dA尾) - 純化 - 連接高保真度的PCR & +dA尾，效率很低長片段克隆，效率很低載體自連，高背景費(fèi)時(shí)入門克隆36TA 克隆方法（ Original TA Cloning Kit ）即利用 Taq 聚合酶同時(shí)具有的末端連接酶的功能，在每條 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物的 3 端自動(dòng)添加一個(gè) 3-A 突出端。利用 T 載體，直接高效地連接 PCR 產(chǎn)物。 原理如下： TA 克隆不需使用含限制酶序列的引物，不需將 PCR 產(chǎn)物進(jìn)行優(yōu)化，不需把 PCR 產(chǎn)物做平端處理，不需在 PCR 擴(kuò)

11、增產(chǎn)物上加接頭，即可直接進(jìn)行克隆。TA CloningTA Cloning37全式金的TOPO Blunt/TA Cloning偶聯(lián)拓樸異構(gòu)酶平末端帶A的粘性末端PCR產(chǎn)物末端平端載體T載體PCR產(chǎn)物平端載體PCR產(chǎn)物T載體38Invitrogen的GateWay Cloning基因重組：Homologous bination(同源重組)Site-specific bination(位點(diǎn)專一性重組)位點(diǎn)專一性重組：在專一酶作用下，在DNA特定位點(diǎn)上發(fā)生斷裂和 重接，從而產(chǎn)生精確的DNA重排的DNA重組方式。特點(diǎn)：1.要專一識(shí)別位點(diǎn)，交換的為短同源片段 2.需要專一酶的識(shí)別，結(jié)合； 3.參與該過

12、程的酶的表達(dá)被細(xì)胞調(diào)節(jié)過程引發(fā)。39位點(diǎn)專一性重組機(jī)制獨(dú)立的環(huán)形分子結(jié)構(gòu)整合到宿主基因組中又稱原噬菌體兩種類型間的轉(zhuǎn)換即整合和切離，都是通過噬菌體 DNA和細(xì)菌DNA之間的位點(diǎn)專一性重組實(shí)現(xiàn)的特定位點(diǎn)叫做附著點(diǎn)(attachment site，att)Invitrogen的GateWay Cloning40GateWay重組機(jī)制Invitrogen的GateWay Cloning41引物設(shè)計(jì)PCR擴(kuò)增插入片段重組反應(yīng)30 min轉(zhuǎn)化 僅需3.5小時(shí)ClonExpress EntryVazyme的ClonExpress Entry42獲取目的基因選擇合適載體體外重組導(dǎo)入宿主細(xì)胞重組子篩選鑒定克隆流程再回顧高保真酶Gelred高保真酶GelredC112/C113C114T4連接酶PCR酶Gelred感受態(tài)43用于功能研究的基礎(chǔ)方法 擴(kuò)增分離轉(zhuǎn)化定點(diǎn)突變44Quick Change擴(kuò)增DpnI 消化轉(zhuǎn)化非指數(shù)模板量大退火定點(diǎn)突變45如果使用 Mut ExpressPhanta Max Exnase擴(kuò)增DpnI 消化轉(zhuǎn)化Vazyme的Mut Express46小結(jié)什么是克隆構(gòu)建無性繁殖系什么是基因克隆構(gòu)建單一的DNA重組體的無性繁殖系47獲取目的基因選擇