醫(yī)學(xué)微生物學(xué)：第10章 非發(fā)酵革蘭陰性桿菌

1、第十章 非發(fā)酵革蘭陰性桿菌 尿標本涂片鏡檢痰標本涂片鏡檢痰標本涂片鏡檢痰標本涂片鏡檢掌握：銅綠假單胞菌、不動桿菌屬、嗜麥芽窄食單胞菌的形態(tài)和培養(yǎng)特征，種屬鑒定。熟悉：非發(fā)酵菌的臨床意義。了解：非發(fā)酵菌的分類。概 述非發(fā)酵菌概念：一大類不能以發(fā)酵形式利用葡萄糖的需氧、無芽胞革蘭陰性桿菌的統(tǒng)稱。 非發(fā)酵菌共性：不發(fā)酵葡萄糖，氧化或產(chǎn)堿型，氧化酶陽性，動力陽性。臨床常見非發(fā)酵菌第一節(jié) 假單胞菌屬 第二節(jié) 不動桿菌屬 第三節(jié) 其他臨床常見非發(fā)酵菌 一、窄食單胞菌屬 二、伯克霍爾德菌屬三、產(chǎn)堿桿菌屬四、軍團菌屬 第一節(jié) 假 單 胞 菌 屬 （Pseudomonas）分類屬于假單胞菌科（Pseudomon

2、adaceae)與人類疾病有關(guān)的主要有11個種。代表菌為銅綠假單胞菌。P159自然界廣泛存在，尤其在潮濕的環(huán)境。存在于生水果蔬菜、游泳池、隱形眼鏡用液、美容劑等。消毒劑、軟膏、透析液及設(shè)備、呼吸道治療裝置、沐浴噴頭中存在。臨床意義院內(nèi)呼吸道感染的首要致病菌，尤其是ICU中插管患者。菌血癥傷口感染泌尿道感染眼部感染耳部感染 形態(tài)和培養(yǎng)特征形態(tài)：桿菌染色性：革蘭陰性排列：散在排列特殊結(jié)構(gòu)： 有鞭毛 無芽胞 無莢膜形態(tài)和培養(yǎng)特征培養(yǎng)特征：專性需氧營養(yǎng)要求不高最適生長溫度30和37最適pH7.0生長過程中產(chǎn)色素（水溶性）各種假單胞菌產(chǎn)生的色素細菌色素顏色銅綠假單胞菌熒光假單胞菌惡臭假單胞菌斯氏假單胞菌

3、洋蔥伯克霍爾德菌腐敗希瓦納拉菌綠膿素、玉紅膿素、綠膿熒光素?zé)晒馑責(zé)晒馑匚炊S色素紫色素、未定名黃色素未定名色素黃綠色、紅色、黃色黃綠色黃綠色黃色紫色、黃色淡紅褐色非發(fā)酵菌科與其他科細菌的區(qū)別試驗?zāi)c桿菌科弧菌科非發(fā)酵菌葡萄糖氧化酶形態(tài)鞭毛F-桿狀周毛或無F+弧形單毛O/-+*桿狀單、叢毛、周毛常見非發(fā)酵革蘭陰性桿菌的初步分群鑒定試驗假單胞菌屬不動桿菌屬產(chǎn)堿桿菌屬黃桿菌屬氧化酶葡萄糖發(fā)酵試驗(O/F試驗)動力+O/-+/-O/-+-+/-O+/-銅綠假單胞菌Pseudomonas aeruginosa簡介廣泛分布于自然界、土壤、水、空氣中。人體皮膚、腸道、呼吸道均有存在，特別是兒童皮膚分離出該菌

4、達25%。條件致病菌，是醫(yī)院感染的主要病原菌之一。臨床意義在各種原因所致的人體抵抗力低下時引起皮膚感染、呼吸道感染、泌尿道感染、燒傷感染等?？蓪?dǎo)致菌血癥、心內(nèi)膜炎、囊性纖維變性。感染眼部的銅綠假單胞菌，可以合成膠原酶，以致引起角膜穿孔而失明。在假單胞菌屬的感染中銅綠假單胞菌的感染占70%2009年銅綠假單胞菌的標本來源致病性銅綠假單胞菌有多種毒力因子，包括結(jié)構(gòu)成分、毒素和酶：粘附素：菌毛多糖莢膜：抗吞噬內(nèi)毒素：LPS外毒素綠膿素：催化產(chǎn)生有毒基團組織損傷彈性蛋白酶磷脂酶C培養(yǎng)特性專性需氧菌，部分菌株能在兼性厭氧條件下生長。營養(yǎng)要求不高，可生長的溫度范圍為2542，最適生長溫度為2530，4 不

5、生長。普通平板上可生長血平板生長良好形態(tài)及培養(yǎng)特征可在麥康凱上生長形態(tài)及培養(yǎng)特征熒光組假單胞菌可產(chǎn)生青膿素（熒光素）銅綠假單胞菌產(chǎn)生的青膿素形態(tài)及培養(yǎng)特征銅綠假單胞菌在平板上可形成5種菌落： 典型型 大腸菌樣型 粘液型 侏儒型 粗糙型粘液型侏儒型大腸菌樣型典型型粗糙型The Colonies of Pseudomonas aeruginosa鏡下形態(tài)銅綠假單胞菌鑒定特征革蘭陰性桿菌，動力陽性（單鞭毛）特征性的菌落、色素、氣味42可生長，4不生長氧化酶（+）、氧化分解葡萄糖乙酰胺水解（+）、還原硝酸鹽生成氮氣精氨酸雙水解（+）生化特征氧化酶陽性觸酶陽性生化特征氧化分解葡萄糖硝酸鹽還原(產(chǎn)N2)（

6、）銅綠假單胞菌檢驗程序腦脊液、胸(腹)水、膿液、分泌物、痰、尿液、十二指腸引流液分離培養(yǎng)血瓊脂平板1.肉浸湯2.胰化酪蛋白 大豆肉湯血液、環(huán)境用品直接涂片革蘭染色糞便分離培養(yǎng)：SS、麥康凱37培養(yǎng)1824h挑選菌落鑒定 初步鑒定 菌落特征、色素、綠膿素：+涂片、革蘭染色、氧化酶：+ 最后鑒定生化反應(yīng)分型：血清學(xué) 噬菌體、綠膿素檢驗結(jié)果分析與報告結(jié)合臨床感染癥狀，患者血、尿液及無菌體液中分離到銅綠假單胞菌，特別是反復(fù)檢出即可確定是感染病原菌。最多見的是在抵抗力低下、長期住院患者出現(xiàn)的院內(nèi)感染。如患者無感染的臨床表現(xiàn)，雖然分離到革蘭陰性桿菌亦應(yīng)作為正常菌群，特別是兒童因為兒童正常皮膚帶菌率高。銅綠

7、假單胞菌可以引起小兒類似沙門氏菌或霍亂樣病的嚴重腹瀉，所以診斷一定要與臨床表現(xiàn)相結(jié)合。2009年銅綠假單胞菌的敏感耐藥率銅綠假單胞菌銅綠假單胞菌的耐藥機制泛耐的銅綠假單胞泛耐：指對所有臨床常用的抗生素均耐藥。除氨基糖苷類(如阿米卡星)外，其余抗生素均耐藥。耐藥機制復(fù)雜。臨床面臨無藥可用的局面。真正的“超級細菌”。青霉素結(jié)合蛋白（PBPs）的改變銅綠假單胞菌的PBPs結(jié)構(gòu)發(fā)生改變后，內(nèi)酰胺類抗生素與PBPs的親合力下降，引起細菌對抗生素的敏感性降低。 外膜通透性的障礙 ：孔蛋白OprD2的缺失細菌對亞胺培南耐藥。一般情況下，小分子水溶性藥物可通過細胞膜的孔蛋白(具有運輸、交換物質(zhì)的作用)進入細菌

8、，但是銅綠假單胞菌缺乏這種典型的通道，導(dǎo)致其具有天然的多重耐藥性。 主動外排(主動泵出)系統(tǒng) (占主導(dǎo)地位)MexA-MexB-OprM：泵出除碳青霉烯類以外的大部分內(nèi)酰胺類藥物、四環(huán)素、氯霉素、氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類藥物 。MexC-MexD-OprJ：泵出第四代頭孢菌素、四環(huán)素、氯霉素、新氟喹諾酮類、大環(huán)內(nèi)酯類 。MexE-MexF-OprN：泵出碳青霉烯類抗生素(亞胺培南、美羅培南)、氯霉素、氟喹諾酮類 。MexX-MexY-OprM：泵出紅霉素、氨基糖苷類、氟喹諾酮類抗菌藥物 。生物膜(Biofilm) 由于存在大量的多糖包被(glycocalyx)，抗生素難于 穿透生物膜而作用于深層

9、的細菌，同時細菌細胞膜通透性降低，使藥物對細菌的敏感性下降。 抗生素可誘導(dǎo)細菌產(chǎn)生內(nèi)酰胺酶。 內(nèi)層的細菌難于獲取養(yǎng)分和氧氣，生長代謝緩慢，對外界刺激(包括抗生素)不敏感。 喹諾酮類藥物對銅綠假單胞菌生物膜有較強的穿透作用。大環(huán)內(nèi)酯類藥物如克拉霉素可顯著減少多糖生成，與其它抗銅綠假單胞菌藥物具有協(xié)同作用。 產(chǎn)內(nèi)酰胺酶 AmpC酶(ClassC)A類超廣譜內(nèi)酰胺酶(ClassA) B類超廣譜內(nèi)酰胺酶(金屬酶) D類超廣譜內(nèi)酰胺酶(ClassD) ETDA篩選金屬酶(雙紙片協(xié)同法)第二節(jié) 不動桿菌屬 （Acinetobacter） 分類至少可分29個基因組其中至少17個已命名： 鮑曼不動桿菌（A b

10、aumanii） 醋酸鈣不動桿菌（A calcoacelicus） 溶血性不動桿菌（A haemolyticus） 約翰遜不動桿菌（A johnonii） 洛菲不動桿菌（A lwoffii） 瓊氏不動桿菌（A junii） 耐放射性不動桿菌（A radioresistens）臨床意義能在潮濕和干燥表面生存條件致病多重耐藥主要引起醫(yī)院感染： 呼吸道感染 泌尿道感染 傷口感染鮑曼不動桿菌引起的感染鮑曼不動桿菌感染鮑曼不動桿菌肺炎 占VAP的510% 鮑曼不動桿菌血流感染ICU 患者死亡率35% 顱腦術(shù)后鮑曼不動桿菌腦膜炎死亡率可達70%濕熱地區(qū)酗酒患者不動桿菌引起CAP死亡率約50%鮑曼不動桿菌引

11、起約2.1%的ICU內(nèi)皮膚軟組織感染伊拉克、阿富汗外傷創(chuàng)口培養(yǎng)中不動桿菌陽性率30%CID 2005; 41:848-54.CID 2004; 39:309-17.JAC 2007; 60:197-9.Chest 2006; 129:102-9.CID 2007; 45:409-15.伊拉克美軍帶回的鮑曼不動桿菌在美國流行http:/www.leishmaniasis.us/Mapping.html菌群變遷中山一院2011年第三季度鮑曼不動桿菌鮑曼不動桿菌全院外科2005-2010年 CHINET監(jiān)測不動桿菌占革蘭陰性菌比例形態(tài)和培養(yǎng)特征形態(tài)：球桿菌排列：常成雙排列染色性： 革蘭陰性（不易脫色

12、）特殊結(jié)構(gòu)： 無鞭毛 無芽胞 粘液型菌株有莢膜 鮑曼不動桿菌革蘭染色鮑曼不動桿菌掃描電鏡培養(yǎng)特性： 專性需氧菌 一般營養(yǎng)要求不高 最適生長溫度3537 鮑曼不動桿菌可在42 生 長，其他不動桿菌不生長。形態(tài)與培養(yǎng)特征鮑曼不動桿菌菌落（普平）血平板： 中等大小、圓形、灰白色、邊緣整齊的菌落，一般不溶血（除溶血不動桿菌外）形態(tài)與培養(yǎng)特征形態(tài)與培養(yǎng)特征醋酸鈣不動桿菌菌落（麥康凱48h）Mac平板： 無色半透明不發(fā)酵乳糖小菌落（溶血不動桿菌） 氧化分解乳糖菌落（鮑曼不動桿菌等）形態(tài)與培養(yǎng)特征鮑曼不動桿菌麥康凱上菌落洛菲不動桿菌麥康凱上菌落生化反應(yīng)不發(fā)酵糖類氧化酶陰性硝酸鹽還原試驗陰性動力陰性觸酶陽性氧

13、化乳糖(溶血不動桿菌除外)不動桿菌檢驗程序： 尿液、痰液、膿汁 直接涂片 分離培養(yǎng) 革蘭染色 （血平板、麥康凱） 35 1824h 鏡檢 可疑菌落 涂片革蘭染色 動力 KIA 全面生化反應(yīng) 革蘭陰性球桿菌 陰性 底層斜面 最終鑒定 氧化酶陰性 不變色 報告抗生素應(yīng)用對于不動桿菌屬，對全部氨基青霉素、一代二代頭孢菌素和一代喹諾酮類抗生素天然耐。酶抑制劑舒巴坦對不動桿菌有一定的抑菌作用。天然攜帶的-內(nèi)酰胺酶AmpC酶：基礎(chǔ)的低水平表達對廣譜頭孢菌素的活性影響很小OXA-51型酶：處于基礎(chǔ)低水平表達的菌株對所有-內(nèi)酰胺類藥物仍然敏感IS（ISAba1，IS1135 等）：增加染色體介導(dǎo)-內(nèi)酰胺酶基因

14、表達，介導(dǎo)AmpC酶對頭孢他啶、OXA-51為對碳青霉烯類抗生素耐藥細胞膜天然的低通透性醋酸鈣不動桿菌對頭孢菌素的通透性比銅綠假單胞菌低2-7倍；碳青霉烯類、頭孢菌素類抗生素在其外膜脂質(zhì)中的擴散速率僅為大腸埃希菌的1-3；鮑曼不動桿菌極可能有類似的特性強大的耐藥基因獲得能力Acinetobacter baylyi ADP1擁有比大腸桿菌感受態(tài)細胞強大100倍的捕獲外源DNA能力錯配修復(fù)系統(tǒng)mutS 的缺失增加了部分不動桿菌的突變頻率不動桿菌中的碳青霉烯酶D類碳青霉烯酶（OXA-23型）B類碳青霉烯酶(IMP、VIM型)A類碳青霉烯酶碳青霉烯類的使用是IR-MDRAB出現(xiàn)的唯一獨立的高危因子Ye

15、 JJ, et al. PLoS One. 2010 Apr 1; 5(4):e9947IMP紙片EDTA2-巰基丙酸陽性對照株結(jié)果臨床標本結(jié)果IMP紙片EDTA2-巰基丙酸產(chǎn)金屬酶的鮑曼不動桿菌鮑曼不動桿菌外排泵近年來， AdeABC外排系統(tǒng)研究成為熱點2013年鮑曼不動桿菌的耐藥率%鮑曼不動桿菌對碳青霉烯類的耐藥率%變遷亞胺培南耐藥鮑曼不動桿菌對替加環(huán)素的MIC（微量肉湯稀釋法）分布圖2012年2013年美國Detroit鮑曼不動桿菌監(jiān)測結(jié)果耐藥性增加伴隨著感染數(shù)上升！AAC, 2010：22352238XDRPDRMDRresistance to 3 classes of antimic

16、robial agentsresistance to all but 1 or 2resistance to allamong those drugsavailable at the time in most parts of the world potentially effectiveMatthew E. Falagas, et al. CID 2008:46(1): 1121-1122泛耐藥菌株（PDR）的治療多粘菌素替加環(huán)素第三節(jié) 其他臨床常見非發(fā)酵菌病例患者，女，年齡17歲，由外院轉(zhuǎn)入我院呼吸科，入院診斷：肺炎、感染性休克抗生素使用情況：入院前已使用較長時間泰能(亞胺培南)，效果不佳

17、。痰培養(yǎng)結(jié)果：嗜麥芽窄食單胞菌生長(+)。你的用藥建議？窄食單胞菌Stenotrophomonas分類屬于假單胞菌科（Pseudomonadaceae)臨床分離有兩個種: 嗜麥芽窄食單胞菌（S.maltophilia ） 非洲寡窄食胞菌（S. africana） 臨床意義 條件致病菌 醫(yī)院感染 臨床最常見為嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌 主要引起菌血癥、腦膜炎、尿路感 染、敗血癥、肺炎Stenotrophomonas maltophilia形態(tài)與培養(yǎng)特征形態(tài)：桿菌排列：散在排列染色性：革蘭陰性特殊結(jié)構(gòu)： 有鞭毛（極端叢鞭毛） 無芽胞 無莢膜嗜麥芽窄食單胞菌革蘭染色嗜麥芽窄食單胞菌鞭毛培養(yǎng)特性： 專性需氧 營

18、養(yǎng)要求不高 最適生長溫度3037 4 不生長 麥康凱平板可生長 Stenotrophomonas maltophilia形態(tài)與培養(yǎng)特征嗜麥芽窄食單胞菌菌落（普平）Stenotrophomonas maltophilia形態(tài)與培養(yǎng)特征嗜麥芽窄食單胞菌菌落（麥康凱）嗜麥芽窄食單胞菌菌落（血平板）生化特征： 氧化酶陰性 氧化分解葡萄糖 快速氧化分解麥芽糖 DNA酶陽性 明膠液化試驗陽性 對碳青霉烯類抗生素天然耐藥Stenotrophomonas maltophilia生化反應(yīng)DNA酶陽性Stenotrophomonas maltophilia鑒定特征革蘭陰性桿菌氧化酶陰性氧化分解葡萄糖和麥芽糖（后者

19、反應(yīng)更強）DNA酶和賴氨酸脫羧酶（+）明膠水解（+）動力（+），鞭毛數(shù)2個對碳青霉烯類抗生素天然耐藥抗生素應(yīng)用根據(jù)2005年美國臨床實驗室標準化委員會(NCCLS)提供的標準：臨床常規(guī)檢測只做復(fù)方新諾明、左旋氧氟沙星、米諾環(huán)素。臨床治療首選復(fù)方新諾明；頭孢哌酮/舒巴坦、替卡西林/克拉維酸保持一定的敏感性。嗜麥芽窄食單胞菌含有金屬酶，對亞胺培南天然耐藥，即使體外試驗敏感，也不應(yīng)該用于臨床治療。2008年嗜麥芽窄食單胞菌藥物敏感率伯克霍爾德菌屬Burkholderia分類：原屬于假單胞菌屬，目前已自成一個獨立的屬。與疾病有關(guān)的有四種： 洋蔥伯克霍爾德菌（B.cepacia） 類鼻疽伯克霍爾德菌（B

20、. pseudomallei） 唐菖蒲伯克霍爾德菌（B.gladioli） 鼻疽伯克霍爾德菌（B. mallei） 臨床意義廣泛分布于自然界水、土和植物中。洋蔥伯克霍爾德菌主要引起醫(yī)院感染。類鼻疽伯克霍爾德菌引起的感染與結(jié)核相似。形態(tài)與培養(yǎng)特征形態(tài)：桿菌排列：散在排列染色性：革蘭陰性特殊結(jié)構(gòu)： 有極端鞭毛(鼻疽伯克霍爾德菌無鞭毛） 無芽胞 無莢膜洋蔥伯克霍爾德菌鞭毛洋蔥伯克霍爾德菌掃描電鏡圖形態(tài)與培養(yǎng)特征培養(yǎng)特征： 專性需氧 最適生長溫度3037 營養(yǎng)要求不高形態(tài)與培養(yǎng)特征血平板48h類鼻疽伯克霍爾德菌菌落生化特征氧化酶陽性觸酶陽性氧化利用葡萄糖硝酸鹽還原（+）動力陽性(鼻疽伯克霍爾德菌陰性)

21、洋蔥伯克霍爾德菌(普通平板)洋蔥伯克霍爾德菌生化特征86%洋蔥伯克霍爾德菌氧化酶陽性觸酶陽性氧化利用大部分糖類不能還原硝酸鹽為N2有多個極端鞭毛(2)耐藥機制耐藥機制不明確，對多種抗生素高度耐藥?？僧a(chǎn)生A類碳青酶烯酶，對亞胺培南天然耐藥，可對美羅培南敏感。米諾環(huán)素、復(fù)方新諾明可用于經(jīng)驗治療。病例住院患者，入住ICU，氣管插管。肺炎確定病原菌痰涂片：可見G-桿菌痰培養(yǎng)：1、灰綠色、溶血菌落(BP，巧克力平板)2、灰色不溶血菌落(BP，巧克力平板)1、G-桿菌，細長，氧化酶+2、G-桿菌，細長，氧化酶-上GN鑒定卡：1、銅綠假單胞菌2、洋蔥伯克霍爾德菌藥敏結(jié)果1、氨曲南：I，多粘菌素B：S，其它抗生素全部耐藥。2、復(fù)方新諾明、米諾環(huán)素S，美羅培南、頭孢他定R。產(chǎn)堿桿菌屬和無色桿菌屬Alcaligenes and chromobacter分類：屬于產(chǎn)堿桿菌科臨床常見的主要是: 糞產(chǎn)堿桿菌 木糖氧化無色桿菌木糖氧化亞種 臨床意義存在于潮濕環(huán)境中條件致病菌