HPK1在缺糖缺氧誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡中的作用

1、HPK1在缺糖缺氧誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡中的作用【摘要】目的觀察造血祖細(xì)胞激酶1HPK1對缺糖缺氧GD誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡的作用。方法采用細(xì)胞免疫熒光技術(shù)通過免疫熒光顯微鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察HPK1是否在大鼠腦細(xì)胞中存在；采用DAPI染色技術(shù)觀察HPK1反義寡核苷酸對GD誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡的作用。結(jié)果在體外培養(yǎng)的原代大鼠海馬神經(jīng)元中有HPK1的表達(dá)。HPK1反義寡核苷酸對GD誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡具有保護(hù)作用，并有劑量依賴性。結(jié)論HPK1反義寡核苷酸對GD誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡具有保護(hù)作用。【關(guān)鍵詞】造血祖細(xì)胞激酶1;缺糖缺氧;凋亡反；義寡核苷酸Abstrat：bjetiveTinve

2、stigatetherlefHPK1inhippapusneurnapptsisinduedbyxygen-glusedeprivatin(GD).ethdsIunfluresenetehniqueasusedtinvestigatehetherthereasHPK1inhippapusneurnundertheflureseneirspeandthenfalirspy.DAPIstainingasusedtinvestigatetherlefHPK1antisenseligdexynuletidesinhippapusneurndeathinduedbyGD.ResultsItasfundt

3、hatHPK1ereexpressedinrathippapusneurnsulturedinvitrandadinistratinfHPK1antisenseligdexynuletidesuldsignifiantlydereasetheapptsisfhippapusneurnshihinduedbyGD.nlusinKnk-dnfHPK1;expressinprvidesneurprtetinagainsttheapptsisfhippapusneurnshihinduedbyGD.Keyrds:HPK1;xygen-glusedeprivatin;apptsis;antisensel

4、igdexynuletide缺血性腦中風(fēng)已成為嚴(yán)重威脅人類生命的疾病，因此積極探究缺血性腦損傷的分子機(jī)制并提出新的治療措施，有著極其重要的醫(yī)學(xué)價值和社會意義。造血祖細(xì)胞激酶1heatpietiprgenitrkinase1，HPK1是造血系統(tǒng)特異性絲氨酸、蘇氨酸蛋白激酶，屬于哺乳動物Ste20相關(guān)蛋白激酶的AP4K家族1。它的N末端由1個STE-20樣激酶構(gòu)造域、4個脯氨酸富集tif、1個aspase切割位點(diǎn)組成，末端為1個itrn同源構(gòu)造域。HPK1主要在造血組織和細(xì)胞中表達(dá)。近年來大量研究結(jié)果說明，HPK1參與許多信號級聯(lián)反響，包括APK(itgen-ativatedprtEinkinas

5、e)信號、抗原受體信號、凋亡信號、生長因子信號以及細(xì)胞因子信號。然而，繼往對于HPK1的研究全部集中在造血系統(tǒng)。本實(shí)驗(yàn)旨在討論HPK1是否存在于大鼠海馬神經(jīng)元中，及其在缺糖缺氧(xygen-glusedeprivatin,GD)所誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡中的作用。1材料和方法1.1實(shí)驗(yàn)動物及材料清潔級孕1718天Sprague-Daley大鼠，徐州醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。高糖DE干粉培養(yǎng)基、無血清神經(jīng)元根底培養(yǎng)基、B-27添加劑為美國GibBRL公司產(chǎn)品,DE/F12為美國Hylne公司產(chǎn)品,胎牛血清、馬血清由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院血液研究所提供,胰酶為美國Dif公司產(chǎn)品,谷氨酰胺由上海實(shí)生細(xì)胞生物技

6、術(shù)公司提供,甘氨酸、D-多聚賴氨酸、4,6-二脒基-2-苯基吲哚(4,6-diaidine-2-phenylindle,DAPI)、聯(lián)苯二胺為美國Siga公司產(chǎn)品,其余試劑為國產(chǎn)分析純。HPK1反義寡核苷酸序列AS-DNs5-AGGGTAGAGTAT-3、HPK1錯義寡核苷酸序列S-DNs5-AAGGTGTAGAGT-3由上海生工生物工程技術(shù)效勞合成。1.2海馬神經(jīng)元培養(yǎng)參考我室顧正林等2報道方法,并略作改動。孕1718天Sprague-Daley大鼠斷頭處死,迅速取出胚胎置于冰冷的DE溶液中,逐一取出胎鼠頭,體視鏡下逐層剝除皮膚、顱骨、腦膜及外表血管,暴露雙側(cè)大腦半球,取海馬剪碎至0.51.

7、03入1520l新穎配制的0.25%胰酶工作液,37消化15in,參加含10%胎牛血清和10%馬血清的冰冷的高糖DE以終止反響,低速離心35in后,吸棄上層溶液并加上述DE溶液輕輕吹散,1000r/in離心5in,再次用上述DE溶液懸浮細(xì)胞,輕輕吹打,200目濾網(wǎng)過濾,以1.0108個/L的密度接種于L-多聚賴氨酸預(yù)處理的24孔培養(yǎng)板中,置于37、5%2培養(yǎng)箱中,1824h換為神經(jīng)元根底培養(yǎng)基全培,半換液23次/周。1.3動物分組及處理隨機(jī)分組：正常對照組(ntrl)，正常細(xì)胞不進(jìn)展GD組；細(xì)胞缺糖缺氧組GD組；溶劑對照組GD+TE組，體外培養(yǎng)1518天的大鼠海馬神經(jīng)元，2l/LTris-ED

8、TA，連續(xù)處理4天后進(jìn)展GD，1.5h后換回正常培養(yǎng)基和52、95空氣、37的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)；錯義寡核苷酸組GD+S，用1、1.5和2l/LHPK1錯義寡核苷酸，連續(xù)處理4天后進(jìn)展GD，方法同TE組；反義寡核苷酸組GD+AS，用1、1.5，和2l/LHPK1反義寡核苷酸，連續(xù)處理4天后進(jìn)展GD，方法同TE組。1.4氧糖剝離(GD)模型的制備首先將培養(yǎng)箱內(nèi)充入氮?dú)獯婵諝?，待條件穩(wěn)定為95氮?dú)狻?%2后將培養(yǎng)14天的海馬神經(jīng)元細(xì)胞移入。同時將原培養(yǎng)液換為不含葡萄糖的DE液(Gib產(chǎn)品)缺糖缺氧1.5h。然后將無糖DE液重新?lián)Q為原培養(yǎng)液。同時添加不同神經(jīng)保護(hù)劑，將細(xì)胞重新置于52、95空氣、37的培

9、養(yǎng)箱內(nèi)復(fù)灌24h后進(jìn)展DAPI染色。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.1.5DAPI熒光染色生長于蓋玻片的細(xì)胞用37的PBS溶液洗2次，4多聚甲醛固定5in，37的PBS溶液再洗2次，加10g/LDAPI(4，6diaidin-2-phenylindle,4，6二氨基2苯基吲哚)，37孵育30in，PBS洗3in2次。在lypusVanx顯微鏡上，以400n入射光激發(fā)，455n承受觀察。實(shí)驗(yàn)結(jié)果的斷定方法為：染色質(zhì)濃縮、甚至碎裂的細(xì)胞為凋亡樣陽性細(xì)胞；陽性細(xì)胞的計算方法：隨機(jī)選取的10個400倍視野下的陽性細(xì)胞總數(shù)占假刺激對照組的百分比。1.6細(xì)胞免疫熒光染色染色前細(xì)胞密度調(diào)整到0.8105/孔24孔板。

10、染色當(dāng)日移去完全培養(yǎng)基，用預(yù)熱至35的PBS洗1次，用4%的多聚甲醛固定20in。然后PBS洗3次，用含0.5TritnX-100的PBS在室溫通透化處理15in，PBS洗3次，用含10羊血清的PBS封閉3h以上，室溫下一抗孵育1h以上，用含0.1Teen-20的PBS漂洗3次，二抗避光孵育2h以上，去除二抗后，再用含0.1Teen-20的PBS漂洗3次，熒光顯微鏡lypus及激光共聚焦顯微鏡LEia觀察，綠色熒光以494n入射光激發(fā)，518n承受，紅色熒光以550n入射光激發(fā)，570n承受，照相。1.7統(tǒng)計學(xué)處理數(shù)據(jù)以s表示，2組間數(shù)據(jù)比擬采用新復(fù)極差法，多組間數(shù)據(jù)比擬采用單因素方差分析AN

11、VA,P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1HPK1在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中的定位結(jié)果如圖1所示，紅色熒光標(biāo)記海馬神經(jīng)元細(xì)胞，綠色熒光標(biāo)記HPK1蛋白，熒光顯微鏡600結(jié)果如圖1-1A所示；同一神經(jīng)元既能被抗HPK1抗體標(biāo)記而顯示綠色熒光a，又能被抗NeuN標(biāo)記而顯示紅色熒光b；共聚焦顯微鏡結(jié)果如圖1-1B所示，對于同一個神經(jīng)元，既能被紅色熒光所標(biāo)記NeuN，又能被綠色熒光所標(biāo)記(HPK1)。結(jié)果提示：在體外培養(yǎng)的原代大鼠海馬神經(jīng)元中有HPK1的表達(dá)。2.2HPK1反義寡核苷酸在GD誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元死亡中的作用反義寡核苷酸組24h后，進(jìn)展DAPI染色。正常對照組圖2Antrl不進(jìn)展GD

12、。結(jié)果顯示：GD可以誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元凋亡圖2AGD,經(jīng)過HPK1AS預(yù)處理的神經(jīng)元的凋亡樣死亡可以從83降低為58GD+1l/LAS、41GD+1.5l/LAS、38GD+2l/LAS。對照組GD+TE組、錯義寡核苷酸組GD+1l/LS、GD+1.5l/LS和GD+2l/LS組對細(xì)胞凋亡樣死亡無明顯影響圖2-B。結(jié)果提示：HPK1反義寡核苷酸對GD誘導(dǎo)的海馬神經(jīng)元凋亡具有保護(hù)作用，并有劑量依賴性。圖1HPK1在體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元中的定位A：600略圖2HPK1反義寡核苷酸在GD誘導(dǎo)的大鼠海馬神經(jīng)元死亡中的作用略AS組與GD組比擬：P0.053討論近年來大量的研究結(jié)果證明，HPK1

13、主要在造血組織和器官中表達(dá)。HPK1是一個97kDa的絲/蘇氨酸蛋白激酶，它在淋巴細(xì)胞中對于調(diào)節(jié)JNK細(xì)胞信號通路起著重要的作用1。但在神經(jīng)系統(tǒng)中HPK1起著什么樣的作用至今未見報道。繼往研究4-5發(fā)現(xiàn)造血祖細(xì)胞瞬時表達(dá)HPK1可以通過LK3-KK4/7-JNK信號通路激活JNK，但不能激活ERK或者p38-APK信號通路。Kiefer等1報道HPK1可以通過它的第3和第4個脯氨酸富集區(qū)與LK3的SH3構(gòu)造域互相作用。在體外實(shí)驗(yàn)中，HPK1通過磷酸化LK3的絲氨酸281位而激活LK3繼而激活JNK。本室早期的研究結(jié)果也證實(shí)LK3在大鼠瞬時腦缺血中發(fā)揮著重要作用。在缺血15in復(fù)灌6h時其磷酸化

14、程度到達(dá)頂峰3,6。于是，我們提出HPK1是否也參與了腦缺血復(fù)灌所引起的神經(jīng)元死亡的細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路呢？因此，我們首先通過免疫熒光技術(shù)檢測了在體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中HPK1的表達(dá)，結(jié)果證實(shí)在體外培養(yǎng)的大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中存在HPK1的表達(dá)。既然HPK1在大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中有表達(dá)，那么它有何作用呢？為了答復(fù)這一問題，我們設(shè)計了HPK1的反義寡核苷酸，在體外培養(yǎng)1518天的大鼠海馬神經(jīng)元，用不同濃度的HPK1AS預(yù)處理海馬神經(jīng)元，結(jié)果發(fā)現(xiàn)HPK1AS預(yù)處理海馬神經(jīng)元組與對照組相比明顯降低了GD誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元的凋亡樣死亡，并且具有劑量依賴性。以上結(jié)果證明，HPK1存在于大鼠海馬神經(jīng)元，并且

15、HPK1AS對于GD誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元的凋亡具有保護(hù)作用。總之，本實(shí)驗(yàn)首次發(fā)現(xiàn)HPK1存在于大鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞中，并且發(fā)現(xiàn)我們設(shè)計的HPK1的反義寡核苷酸對于GD誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元的凋亡具有保護(hù)作用。這對今后我們進(jìn)一步研究HPK1在全腦缺血中的作用及其分子機(jī)制提供了新的思路?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1KieferF,TibblesLA,Anafi,etal.HPK1,aheatpietiprtEInkinaseativatingtheSAPK/JNKpathayJ.EBJ，1996，15(24):7013-7025.2GuZ,JiangQ,ZhangG.-JunN-terinalkinaseativatininh

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