動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的準(zhǔn)備

1、動(dòng)物細(xì)胞培養(yǎng)的準(zhǔn)備第1頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二 玻璃器皿 金屬器械 橡膠 塑料制品 第2頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二玻璃器皿的清洗 浸泡（自來水） 刷洗（洗衣粉） 酸泡（24小時(shí)） 自來水沖洗蒸溜水浸泡和沖洗 50烘干 橡膠、塑料制品的清洗 清水清洗浸于自來水過夜用紗布或棉簽和50稀洗液刷洗流水沖洗（1520遍） 晾干浸于清潔液15分鐘流水沖洗（1520遍） 蒸餾水浸洗三次，三蒸水泡24小時(shí)晾干或50烘干備用。第3頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二金屬器械的清洗 放到含洗滌劑的水中反復(fù)刷洗后自來水反復(fù)沖洗干

2、凈晾干用75酒精擦拭自來水反復(fù)沖洗干凈最后三蒸水浸洗3次，晾干或50烘干備用。 正壓除菌濾器的清洗 含稀洗滌劑的水中，反復(fù)刷洗后流水沖洗15min 漓水蒸餾水浸泡24h 三蒸水浸泡24h 晾干或50烘干備用。第4頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二塑料器材常用的塑料器材有多孔培養(yǎng)板（4孔、6孔、12孔、24孔、96孔）、培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶及吸頭。重復(fù)使用的處理步驟： 自來水刷洗 3HCl或2NaOH溶液浸泡過夜 自來水充分沖洗 雙蒸水沖洗3次 紫外線直接照射或輻照滅菌第5頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二清洗時(shí)應(yīng)注意： 浸泡、煮沸、酸泡的器皿內(nèi)要充滿液

3、體，不得有氣泡。 沖洗時(shí)要流水振蕩沖洗，方法是：每瓶灌2/3容積的自來水，振蕩后倒掉，重復(fù)15-20次。 煮沸前水面要高于器材5厘米，水沸后投入洗滌劑第6頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二配制時(shí)先在容器中加入蒸餾水，加熱溶解重鉻酸鉀， 再將容器置流動(dòng)自來水中，待重鉻酸鉀液冷卻后， 緩慢加入濃硫酸，邊加邊攪拌。重鉻酸鉀（克）濃硫酸（毫升）蒸餾水（毫升）弱液1001001000次強(qiáng)液1202001000強(qiáng)液631000200組成強(qiáng)度第7頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二包裝材料：牛皮紙 硫酸紙 鋁箔 紗布 金屬消毒桶 鋁質(zhì)飯盒方式：全包裝 局部包裝第

4、8頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二包裝時(shí)應(yīng)注意：手指與器材接觸面積要小，手指不能觸及器材的使用端；封閉器材使用端，標(biāo)記器材手持端；小包裝；玻璃管道口（尖吸管、移液管手持端等）加棉花。第9頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二消毒滅菌方法清除或殺滅物品 上的一切微生物, 以殺滅芽孢為準(zhǔn)第10頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二物理法1：紫外線消毒紫外線直接照射消毒是各實(shí)驗(yàn)室常用的方法；主要用于培養(yǎng)室空氣、操作臺(tái)、塑料培養(yǎng)皿和培養(yǎng)板等表面消毒。紫外線消毒時(shí)產(chǎn)生臭氧，對(duì)身體有害，故紫外線消毒停止后30分鐘才可入室工作。目前有的實(shí)驗(yàn)室

5、采用電子滅菌燈代替紫外燈進(jìn)行空氣消毒。第11頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二紫外線消毒法是利用紫外線照射，使菌體蛋白發(fā)生光解、變性，菌體內(nèi)的核酸、酶遭到破壞而死亡的一種消毒方法。紫外線的殺菌力與其波長(zhǎng)密切相關(guān)，最佳殺菌波長(zhǎng)為250-270nm. 第12頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二光照消毒法主要利用紫外線照射，使菌體蛋白發(fā)生光解變性而導(dǎo)致細(xì)菌死亡，常用方法有： 日光曝曬消毒法 日光曝曬法用于枕頭、床褥、床墊、棉絮等的消毒，一般曝曬6 h可達(dá)到消毒，曝曬時(shí)2 h翻面一次 紫外線消毒法 紫外線消毒法用于空氣消毒與物品表面的消毒 第13頁(yè)，共90

6、頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二物理法2：干熱消毒干熱是指相對(duì)濕度在20%以下的高熱，由空氣導(dǎo)熱，傳熱 較慢，干熱消毒滅菌常用的方法;1.焚燒滅菌法;2.燃燒滅菌法;3.干烤消毒滅菌法:用于高溫下不變質(zhì)、不損壞、不蒸發(fā)的物品，如油劑、粉劑、玻璃器具、金屬制品等; 玻璃器皿，160oC 90-240mins4.微波消毒滅菌法:用于食品及餐具的消毒 醫(yī)療藥品及耐熱非金屬材料物品的消毒滅菌第14頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二物理法3：濾過消毒目前細(xì)胞培養(yǎng)工作中采用的培養(yǎng)用液，包括人工合成培養(yǎng)液、血清、消化用胰酶等常含有維生素、蛋白、多肽、生長(zhǎng)因子等物質(zhì)，這

7、些物質(zhì)在高溫或射線照射下易發(fā)生變性或失去功能，因而上述液體多采用濾過消毒以除去細(xì)菌 。第15頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二濾膜使用時(shí)應(yīng)注意：濾膜薄且光滑，容易移動(dòng)，安裝時(shí)膜位置一定要放正。過分干燥的濾膜很脆，在高壓或高溫干燥時(shí)易破裂，因此安裝前可先用三蒸水潤(rùn)濕濾膜。為保證過濾效果，在使用時(shí)，每次墊兩張濾膜，上面一張孔徑為045微米，下面一張孔徑為022微米，或兩張均為022微米。使用無(wú)齒玻片鑷子夾取濾膜，以防止鑷齒弄破濾膜。加大壓力時(shí)用力應(yīng)均勻，用后打開濾器對(duì)光檢查濾膜是否移動(dòng)和有無(wú)破裂。第16頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二用于濾過除菌的

8、各式濾器濾過除菌法：培養(yǎng)基、血清、消化酶、抗生素等。第17頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二物理法4： 濕熱滅菌濕熱由空氣和水蒸氣導(dǎo)熱，傳熱快，穿透力強(qiáng)，濕熱消毒滅菌常用的方法： 煮沸消毒法 高壓蒸汽滅菌法，一般高壓蒸汽滅菌的壓力為102. 97-137.30 kPa，溫度為1211260C經(jīng)15-30 min可達(dá)到滅菌目的最常用、最有效的方法；布、金屬、橡膠、玻璃、某些培養(yǎng)液培養(yǎng)液，橡膠：10磅（115oC）20mins； 玻璃、金屬： 12磅（121oC）30mins；第18頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二高壓蒸汽滅菌器第19頁(yè)，共90頁(yè)，

9、2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二化學(xué)消毒滅菌法化學(xué)消毒滅菌法是利用化學(xué)藥物滲透細(xì)菌體內(nèi)，使菌體蛋白凝固變性，干擾細(xì)菌酶的活性，抑制細(xì)菌代謝和生長(zhǎng)或損害細(xì)菌膜的結(jié)構(gòu)，改變其滲透性，破壞其生理機(jī)能等，從而達(dá)到消毒滅菌目的第20頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二化學(xué)消毒劑的使用原則(1)根據(jù)物品的性能及微生物的特性，選擇合適的消毒劑。 (2)嚴(yán)格掌握消毒劑的有效濃度、消毒時(shí)間及使用方法。 (3)消毒劑應(yīng)定期更換，易揮發(fā)的消毒劑要加蓋，并定期檢測(cè)，調(diào)整其濃度。(4)浸泡前將物品洗凈擦干，浸沒在消毒液內(nèi)的物品應(yīng)注意打開軸節(jié)或套蓋，管腔內(nèi)應(yīng)注滿消毒液。 (5)在使用前用

10、無(wú)菌生理鹽水沖凈消毒后的物品，避免消毒劑刺激人體組織 第21頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二化學(xué)消毒劑的分類l、高效消毒劑 高效消毒劑可殺滅一切微生物，包括芽孢 (碘酊、福爾馬林等) 2、中效消毒劑 中效消毒劑可殺滅細(xì)菌繁殖體，不能殺滅芽孢(乙醇、碘伏等) 3、低效消毒劑 低效消毒劑可殺滅細(xì)菌繁殖體，不能殺滅結(jié)核桿菌、親水性病毒或芽孢(苯扎溴銨、氯己定等) 第22頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二化學(xué)消毒劑的使用方法浸泡法 侵泡法是將物品洗凈、擦干后，浸沒在消毒液中進(jìn)行消毒滅菌的方法。 擦拭法 擦拭法是用消毒劑直接擦拭人體或物品表面，如皮膚、桌

11、椅等，達(dá)到消毒滅菌的方法。 噴霧法 噴霧法是利用噴霧器將消毒劑變成微粒氣霧彌散在空氣中對(duì)空氣和物品表面進(jìn)行消毒滅菌的方法。 熏蒸法 熏蒸法是將消毒劑加熱或加人氧化劑，使其產(chǎn)生氣體來進(jìn)行消毒滅菌的方法。第23頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二常用消毒劑過氧乙酸 peracetic acid 福爾馬林formalin （37 -40%的甲醛溶液) 戊二醛glutaraldehyde 環(huán)氧乙烷ethylene oxide 含氯消毒劑 乙醇alcohol 苯扎漠銨(新潔爾滅) 第24頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二過氧乙酸消毒效力：高效 0.2用于手消

12、毒，浸泡1- 2min 0.5用于用具消毒，浸泡30 - 60 min 0.2 -0.5用于物體表面消毒，或浸泡10 min 1 -2用于空氣消毒，8 mL/m3，加熱熏蒸，密閉門窗30-120 min 第25頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二注意事項(xiàng)： 對(duì)金屬有腐蝕性，不可用于金屬器械的消毒； 易氧化分解而降低殺菌力，需現(xiàn)配現(xiàn)用； 濃溶液有腐蝕性，配制時(shí)要戴口罩和橡膠手套；存放于陰涼避光處，防高溫引起爆炸； 第26頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二福爾馬林(37 -40%的甲醛溶液)消毒效力：高效 40甲醛210 mLm3加水420 mL加熱，

13、作室內(nèi)物品及空氣消毒； 40甲醛4060 mLm3加高錳酸鉀2040 g，柜內(nèi)熏蒸，密閉612 h； 10甲醛可作浸泡器械消毒第27頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二注意事項(xiàng)： 蒸汽穿透力弱，因此衣服應(yīng)掛起消毒； 消毒效果易受溫度、濕度影響，要求室溫在18以上，相對(duì)濕度在70以上； 對(duì)人體有一定毒性和刺激性，使用時(shí)注意防護(hù)；第28頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二戊二醛消毒效力：高效 濃度和用法：2戊二醛溶液加入0.3碳酸氫鈉，成為2堿性戊二醛，用于浸泡不耐高溫的金屬器械、醫(yī)學(xué)儀器、內(nèi)鏡等，消毒需10-30 min，滅菌需7-10 h.第29頁(yè)，

14、共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二注意事項(xiàng)： 每周過濾1次，每2周應(yīng)更換消毒液1次； 浸泡金屬類物品時(shí)，加入0.5亞硝酸鈉作為防銹劑 ；消毒滅菌后的物品，使用前用無(wú)菌蒸餾水沖凈第30頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二含氯消毒劑含氯消毒劑：常用的有漂白粉消毒效力：中、高效 濃度和用法： 0.5漂白粉溶液、0.51氯胺溶液用于浸泡餐具、便器等，浸泡30 min ；13漂白粉溶液、0.53氯胺溶液噴灑或擦拭地面、墻壁及物品表面； 排泄物消毒：干糞5份加漂白粉1份攪拌，放置2 h，尿液100 mL加漂白粉1 g，放置1 h第31頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月

15、20日，16點(diǎn)12分，星期二注意事項(xiàng)： 消毒劑保存在密閉容器內(nèi)， 置于陰涼、干燥、通風(fēng)處，減少有效氯的喪失； 配制的溶液性質(zhì)不穩(wěn)定，應(yīng)現(xiàn)配現(xiàn)用； 有腐蝕及漂白作用，不宜用于金屬制品、有色衣服及油漆家具的消毒； 3 d更換一次消毒液第32頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二乙醇消毒效力：中效 濃度和用法：70-75用于皮膚消毒 95用于燃燒滅菌 注意事項(xiàng)： 易揮發(fā)，需加蓋保存，定期測(cè)定，保持有效濃度 有刺激性，不宜用于黏膜及創(chuàng)面消毒 易燃，故應(yīng)置于避火處第33頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二苯扎漠銨(新潔爾滅)消毒效力：低效0.1-0.2用于皮膚消

16、毒 0.1%-0.2用于金屬器械消毒，浸泡15-30 min (加入0.5亞硝酸鈉以防銹)第34頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二注意事項(xiàng)： 對(duì)肥皂、碘、高錳酸鉀等陰離子表面活性劑有拮抗作用 有吸附作用，會(huì)降低藥效，所以溶液內(nèi)不可投人紗布、棉花等 對(duì)鋁制品有破壞作用，故不可用鋁制品盛裝第35頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二 75酒精、新潔爾滅、過氧乙酸、乳酸和洗必泰等都是常用的有效消毒劑。 0.5的過氧乙酸在10分鐘內(nèi)可將芽孢菌和各種病毒殺死； 乳酸蒸汽常用做無(wú)菌室內(nèi)或周圍環(huán)境的定期消毒； 75酒精常用于超凈臺(tái)的臺(tái)面、器械、實(shí)驗(yàn)操作者的皮膚等的

17、消毒; 0.1新潔爾滅用于對(duì)桌、椅、地面、皮膚、操作臺(tái)面進(jìn)行擦拭或浸泡消毒； 0.1洗必泰水溶液用于皮膚浸泡消毒。第36頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二總結(jié)：物理消毒（1）射線消毒：60Co、X射線，用于血清和塑料制品滅菌。（2）紫外線：器皿需結(jié)合75酒精浸泡，照射30min。（3）干熱滅菌：160C，90120 min。主要用于玻璃、金屬器皿。（4）濕熱滅菌：121C，30 min；適用布、橡膠、某些塑料、金屬、玻璃等。（5）過濾除菌：用孔徑小于0.22m的濾膜過濾，適用于培養(yǎng)用液和其他不能高壓滅菌的溶液。第37頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星

18、期二總結(jié)：化學(xué)消毒（1）70（75）酒精：用于手、器械、工作臺(tái)面。（2）0.1新潔爾滅：主要用于手的清洗和工作臺(tái)面的清洗。（3）來蘇水：主要用于桌椅、墻壁、地面的消毒，也可用于空氣消毒。（4）0.5%過氧乙酸：10min可將芽孢菌殺死，用于表面消毒。 （5）其他：乳酸、甲醛、高錳酸鉀、氯等。第38頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二無(wú)菌室的滅菌： 1.定期打掃無(wú)菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺(tái)等，然后用3來蘇爾或者新潔爾 滅或者0.5過氧乙酸擦拭。 2.CO2孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3新潔爾滅擦拭，然后用75酒精擦拭或者0.5過氧乙酸，再用紫外燈照射

19、3.實(shí)驗(yàn)前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機(jī)、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘4.實(shí)驗(yàn)后滅菌：用75酒精（3新潔爾滅）擦拭超凈臺(tái)、邊臺(tái)、倒置顯微鏡的載物臺(tái)。第39頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二實(shí)驗(yàn)人員的無(wú)菌準(zhǔn)備：1.肥皂洗手。2.穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋3.用75酒精棉球擦凈雙手。第40頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二無(wú)菌操作的注意事項(xiàng)：1.凡是帶入超凈工作臺(tái)內(nèi)的酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶的瓶子均要用75酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精燈火焰操作。3.器皿使用前必須過火滅菌4.繼續(xù)使用的器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時(shí)仍要過

20、火。5.各種操作要靠近酒精燈，動(dòng)作要輕、準(zhǔn)確，不能亂碰。如吸管不能碰到廢液缸。6.吸取兩種以上的使用液時(shí)要注意更換吸管，防止交叉污染。第41頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二培養(yǎng)前準(zhǔn)備器材物品放到操作場(chǎng)所（培養(yǎng)室、超凈臺(tái)）內(nèi)消毒。 第42頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二操作間消毒每天0.2% 新潔爾滅拖地；每天紫外線照射分鐘超凈臺(tái)在每次試驗(yàn)前用酒精擦拭，然后紫外線消毒分鐘第43頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二洗手和著裝火焰消毒操作：動(dòng)作準(zhǔn)確敏捷避免手碰到器皿布局合理瓶口順風(fēng)不同移液管取液不能講話、咳嗽第44頁(yè)，共90頁(yè)

21、，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二專門人配液，滅菌，標(biāo)簽一切用品固定存放；“避免污染”第45頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二第二節(jié)、細(xì)胞培養(yǎng)用液第46頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二水：平衡鹽溶液（BBS） ：消化液：培養(yǎng)基抗生素液：染色液：第47頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二（一）水第48頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二（二）平衡鹽溶液維持滲透壓、調(diào)節(jié)PH值細(xì)胞生存能量、無(wú)機(jī)離子第49頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二成分：無(wú)機(jī)鹽葡萄糖用途：洗滌配制其

22、他溶液的基礎(chǔ)溶液可加指示劑BBS 作用：提供細(xì)胞生長(zhǎng)的基本元素；維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度；第50頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二平衡鹽溶液：無(wú)Ca2+、Mg2+的緩沖液 PBS： NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20g 加水至1000 ml第51頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二（三）消化液作用：貼附型細(xì)胞原代培養(yǎng)和傳代培養(yǎng)過程中細(xì)胞和組織的分散；胰蛋白酶液：使細(xì)胞間蛋白質(zhì)水解， 細(xì)胞分散EDTA（二乙烯四乙酸二鈉）： 吸取Ca2，Mg2，使細(xì)胞分離膠原酶 原代培養(yǎng)分散組織細(xì)

23、胞聯(lián)用第52頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二胰蛋白酶消化液來源：豬或者牛的胰臟，白色粉末作用：水解細(xì)胞之間的蛋白質(zhì)濃度：0.25% 0.125%特點(diǎn)：不同細(xì)胞的要求不同終止：血清可以中止胰蛋白酶的繼續(xù)作用第53頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二EDTANa又稱Versen溶液化學(xué)鰲合劑對(duì)細(xì)胞具有一定的解離作用毒性小，價(jià)格低0.02%第54頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二膠原酶溶液來源：細(xì)菌作用：對(duì)膠原組織和細(xì)胞間質(zhì)有較強(qiáng)的消化作用。第55頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二細(xì)胞培養(yǎng)用容器及培養(yǎng)基C

24、ulture vessels and mediumfor animal cell culture二、培養(yǎng)基（液）第56頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二培養(yǎng)基（液）是維持體外細(xì)胞生存和生長(zhǎng)的溶液天然培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基：氨基酸、維生素、糖類 無(wú)機(jī)離子、其它成分 完全培養(yǎng)基：合成培養(yǎng)基+血清無(wú)血清培養(yǎng)基： 第57頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二（一）天然培養(yǎng)基天然培養(yǎng)基有生物性液體（血清）， 組織浸液（胚胎浸液），凝固劑（血漿）優(yōu)點(diǎn)：營(yíng)養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好缺點(diǎn)： 來源受限。 成分復(fù)雜，影響對(duì)某些實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物的提取 和實(shí)驗(yàn)結(jié)果的分析。 易發(fā)生支原體污染

25、第58頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二 血清(serum)： 一般常用為小牛血清(包括胎牛血清)，人血清和其它動(dòng)物血清。滅活：56度，30min消除補(bǔ)體活性。 球蛋白不高于2g/100ml外觀：透明淡黃色，無(wú)溶血，無(wú)沉淀。1、血清第59頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二第60頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二常用血清有胎牛血潔,新生牛血清,小牛血清,兔血清,馬血清等,其中以胎牛血清質(zhì)量最好.優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn):透明,淡黃色,無(wú)沉淀物,無(wú)細(xì)菌,支原體,病毒污染. 第61頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二

26、多種PR（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）多種金屬離子激素；促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等。各種生長(zhǎng)因子轉(zhuǎn)移蛋白不明成分第62頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二血清的使用與儲(chǔ)存 使用前的處理 56滅活30min 去除補(bǔ)體成分 儲(chǔ)存條件 滅活后分裝成小包裝（10mL、20mL、50mL），20 儲(chǔ)存；使用前4 融化，可用1個(gè)月。 使用濃度 一般為520，最常用的是10。第63頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二影響血清的各種因素 年齡：較老動(dòng)物的血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有抑制作用 血型：AB型血清比A型和O型血清對(duì)細(xì)胞生長(zhǎng)有利 血色素 膽紅質(zhì) 脂肪酸 血

27、清在培養(yǎng)液中的濃度并非越高越好第64頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二細(xì)胞培養(yǎng)中使用血清的缺點(diǎn) 使用血清有可能改變某種細(xì)胞在體內(nèi)的正常狀態(tài)。 如：血清可以促進(jìn)成纖維細(xì)胞的生長(zhǎng)，同時(shí)會(huì)抑制表皮角質(zhì)細(xì)胞的生長(zhǎng)。 血清中含有一些物質(zhì)對(duì)細(xì)胞會(huì)產(chǎn)生毒性作用。 如：多胺氧化酶每批血清之間都有差別，其成分不能保持一致。取材過程中有可能帶入支原體、病毒，對(duì)培養(yǎng)細(xì)胞產(chǎn)生影響。第65頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二關(guān)于血清的幾個(gè)問題 血清必須貯存于20 -70，若存放于4，請(qǐng)勿超過一個(gè)月。如果一次無(wú)法用完一瓶，可將4045 ml分裝于無(wú)菌50ml 離心管中，由于血

28、清結(jié)凍時(shí)體積會(huì)增加約10 %， 必須預(yù)留此膨脹體積之空間，否則易發(fā)生污染或容器凍裂之情形。 一般廠商提供之血清為無(wú)菌，不需再無(wú)菌過濾。若發(fā)現(xiàn)血清有許多懸浮物，則可將血清加入培養(yǎng)基內(nèi)一起過濾，勿直接過濾血清。第66頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二 瓶裝(500ml) 血清解凍步驟(逐步解凍法): -20或70至4冰箱溶解一天，至室溫下全溶后再分裝，一般以50 ml 無(wú)菌離心管可分裝4045 ml。在溶解過程中須規(guī)則搖晃均勻(小心勿造成氣泡)，使溫度與成分均一，減少沉淀的發(fā)生。勿直接由20直接至37解凍，因溫度改變太大，容易造成蛋白質(zhì)凝結(jié)而發(fā)生沉淀。第67頁(yè)，共90頁(yè)，2

29、022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二血漿：1907年Harrison首次使用優(yōu)點(diǎn)：支持培養(yǎng)組織塊，供給細(xì)胞生長(zhǎng)物質(zhì)。 缺點(diǎn)：易于液化。2、血漿第68頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二閱讀：P484、水解乳蛋白5、膠原回答：膠原在細(xì)胞培養(yǎng)中的用途？ 膠原的制備方法？ 膠原的使用方法？第69頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二（二）合成培養(yǎng)基 合成培養(yǎng)基：根據(jù)細(xì)胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。 主要成分：氨基酸、維生素、碳水化合物、無(wú) 機(jī)鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點(diǎn)： 標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對(duì)固定。 成本低 缺點(diǎn)： 缺少某些成

30、分，不能完全滿足體外細(xì) 胞生長(zhǎng)需要。 第70頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二常用合成培養(yǎng)基MEM: 12種氨基酸 +谷氨酰胺 + 8種維生素廣泛適用已建成細(xì)胞系的培養(yǎng)minimum essential medium第71頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二DMEM: MEM改良 成份加倍葡萄糖(高糖1000mg/L或者低糖400mg/L) 低糖: 生長(zhǎng)速度快,附著性稍差的腫瘤細(xì)胞 ; 高糖: 附著性差的細(xì)胞第72頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二RPMI-1640: 成份簡(jiǎn)單, 正常細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞,廣泛適用第73頁(yè)，共90

31、頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二干粉培養(yǎng)基商品培養(yǎng)液第74頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二完全培養(yǎng)基也叫血清培養(yǎng)基;分成細(xì)胞生長(zhǎng)和細(xì)胞維持培養(yǎng)基細(xì)胞生長(zhǎng)培養(yǎng)基: 血清含量高, 10-20%維持培養(yǎng)基:血清含量低, 2-5%第75頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二完全培養(yǎng)基配制舉例:基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80一95血清 5一20碳酸氫鈉 2.0 g/L青霉素 50100IU/ml培養(yǎng)液鏈霉素 50100ug/ml培養(yǎng)液第76頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二配制:RPMI-1640培養(yǎng)粉 1袋碳酸氫鈉 2.0 g青、

32、鏈霉素 各100IU/ml 加三蒸水至1000ml, 過濾除菌,調(diào)節(jié)pH值至7.2 ,加血清（終濃度10）.第77頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二（三）無(wú)血清培養(yǎng)基第78頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二 血清中不僅存在促細(xì)胞生長(zhǎng)因子，同對(duì)也存在細(xì)胞生長(zhǎng)抑制因子或毒性因子，故在含血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)的細(xì)胞所反映的生物學(xué)特性是細(xì)胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。 在生長(zhǎng)因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達(dá)調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細(xì)胞 第79頁(yè)，共90頁(yè)，2022年，5月20日，16點(diǎn)12分，星期二 1975年，Sato首次成功地用無(wú)血清培養(yǎng)基培養(yǎng)了垂體細(xì)胞株，近20多年來已報(bào)道了幾十種細(xì)胞系在無(wú)血清培養(yǎng)基中