動物基因組和的提取

1、動物基因組和的提取第1頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一原理1、核酸的分類 DNA (脫氧核糖核酸) 主要存在于細胞核的染色體中。 核外也有少量DNA，如線粒體DNA（mtDNA），葉綠體DNA（cpDNA），質(zhì)粒DNA。 RNA（核糖核酸） 存在于細胞質(zhì)中，如mRNA, rRNA, tRNA等。 除上述DNA，RNA外，還有非細胞形式存在的病毒和噬菌體，其或只含DNA，或只含有RNA。第2頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一核酸的理化性質(zhì)在細胞內(nèi)通常與蛋白質(zhì)結(jié)合，以復(fù)合物形式存在2、核酸制備的一般原則微溶于水，不溶于乙醇，氯仿等有機溶劑在酸性溶液

2、中容易降解，在中性或弱堿性溶液中較穩(wěn)定。DNA溶液粘度很大，RNA的粘度較小在強大離心力的作用下，可以從溶液中沉降下來第3頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一分離純化核酸總的原則：2、核酸制備的一般原則核酸純化應(yīng)達到的要求： 核酸樣品中不應(yīng)存在對酶有抑制作用的有機溶劑和過高濃度的金屬離子； 其它生物大分子的污染應(yīng)降低到最低程度； 排除其它核酸分子的污染。 應(yīng)保證核酸一級結(jié)構(gòu)的完整性； 排除其它分子(蛋白，脂類，多糖類)的污染。第4頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一核酸制備時應(yīng)注意的事項: 盡量簡化操作步驟，縮短提取過程。 減少化學(xué)因素對核酸的降解。

3、 減少物理因素對核酸的降解：機械剪切力和高溫 防止核酸的生物降解：排除核酸酶。 第5頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一 降低溫度，改變pH及鹽的濃度，都利于對核酸酶活性的抑制，但均不如利用核酸酶抑制劑更有利，當(dāng)然，幾個條件并用更好。 對于DNA，抑制DNase活力很容易，但防止機械張力拉斷則更重要。 對于RNA，因分子較小，不易被機械張力拉斷，但抑制RNase活力較難，故在RNA提取中設(shè)法抑制RNase更重要。核酸酶的抑制和抑制劑 第6頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一DNase抑制 加入少量金屬離子螯合劑，如0.01 mol/L EDTA或檸檬

4、酸鈉，DNase基本可以全部失活。 去垢劑、蛋白變性劑及DNase抑制劑也可使DNase失活。第7頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一RNase抑制 操作要帶手套。 所有器皿要嚴格消毒， 試劑處理 低溫操作 在分離過程中要加入一定的RNase抑制劑。 第8頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一 常用的RNA酶抑制劑 焦磷酸二乙酯（DEPC） 抑制強烈、不徹底 異硫氰酸胍 有效抑制、分解核蛋白 氧釩核糖核苷復(fù)合物 有效抑制 RNA酶的蛋白抑制劑（RNasin） 有效抑制 其它：SDS、尿素、硅藻土等 有效抑制上述大部分試劑有致癌之嫌，應(yīng)謹慎操作！第9頁，

5、共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一核酸制備中常用的去垢劑 核酸本身帶負電荷，結(jié)合帶正電荷的蛋白質(zhì)。用于核酸提取的去垢劑，一般都是陰離子去垢劑。 去垢劑的作用： 1溶解膜蛋白及脂肪，使細胞膜破裂； 2溶解核糖體上面的蛋白質(zhì)，使其解聚，將核酸釋放出來； 3對RNase、DNase有一定的抑制作用。如：SDS、脫氧膽酸鈉、4-氨基水楊酸鈉、萘-1.5-二磺酸鈉、三異丙基萘磺酸鈉第10頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一 作用： 1.使蛋白質(zhì)變性、沉淀，從核酸提取液中分離除去，以防造成蛋白污染。 2.使蛋白質(zhì)變性，故可使核糖體解聚釋放出核酸。 3.某些蛋白質(zhì)變

6、性劑也有抑制 RNase活性和破裂細胞的作用。 如：苯酚、氯仿、鹽酸胍、DEPC核酸制備中常用的蛋白質(zhì)變性劑第11頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一核酸制備中常用的酶 DNase: 降解DNA RNase：降解RNA 蛋白酶K：降解蛋白質(zhì) 溶菌酶：破碎細胞 第12頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一3. 核酸制備的一般步驟：破碎組織細胞提取純化I.材料準(zhǔn)備II.破碎細胞或包膜內(nèi)容物釋放III.核酸分離、純化IV.沉淀或吸附核酸，并去除雜質(zhì)V.核酸溶解在適量緩沖液或水中第13頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一1）破碎細胞（防止

7、核酸酶的作用） 微生物：溶菌酶、SDS裂解。 高等植物：搗碎器破碎、液氮研磨。 酶法：蛋白酶，如胰蛋白酶， 冰凍法：反復(fù)凍融或液氮凍后組織搗碎。 動物：液氮處理后用勻漿器或者研缽破碎。 細胞器DNA：首先純化細胞器。以上處理時均要同時加入核酸酶抑制劑第14頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一2）破碎抽提核酸除去雜質(zhì)首先使脫氧核糖核蛋白、核糖體、病毒的核蛋白與其它成分分離使核酸與蛋白質(zhì)分離除去脂類 多糖的除去第15頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一 3）核酸的純化 根據(jù)所需核酸的性質(zhì)和特點除去其它核酸污染,并除去提取過程中的系列試劑(鹽、有機溶劑等）

8、雜質(zhì)，最后得到均一的核酸樣品。 第16頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一4）核酸樣品的保存 核酸保存的主要條件是溫度和介質(zhì) 溫度： 4 樣品經(jīng)常使用 -70是長期保存的良好溫度，為一次性保存 -20保存,避免反復(fù)凍融 保存介質(zhì)： 滅菌水 TE緩沖溶液(最常用)： 10mmol/L Tris-Cl pH8.0 1mmol/L EDTA pH8.0第17頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一一、動物基因組DNA的提取主要方法：(1)濃鹽法 利用RNP和DNP在電解溶液中溶解度不同，將二者分離。 1）用1M 氯化鈉提取,得到的DNP粘液 2) 與含有少量辛

9、醇的氯仿一起搖蕩,使乳化 3) 離心除去蛋白質(zhì),此時蛋白質(zhì)凝膠停留在水相及氯仿相中間，而DNA位于上層水相中 4) 用2倍體積95%乙醇可將DNA 鈉鹽沉淀出來第18頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一一、動物基因組DNA的提?。?）陰離子去污劑法: 用SDS或二甲苯酸鈉等去污劑使蛋白質(zhì)變性, 可以直接從生物材料中提取DNA。 由于細胞中DNA與蛋白質(zhì)之間常借靜電引力或配位鍵結(jié)合, 而陰離子去污劑能夠破壞這種價鍵,所以常用陰離子去污劑提取DNA。第19頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一一、動物基因組DNA的提取（3）苯酚抽提法: 苯酚作為蛋白變性劑

10、,同時抑制了DNase的降解作用。 用苯酚處理勻漿液時, 由于蛋白與DNA 連接鍵已斷, 蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。 蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。離心分層后取出水層，多次重復(fù)操作，再合并含DNA 的水相。 利用核酸不溶于醇的性質(zhì)，用乙醇沉淀DNA 。此法的特點是使提取的DNA保持天然狀態(tài) 。第20頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一DNA的提?。罕椒映樘岱?. 材料、設(shè)備及試劑材料：冷凍或新鮮抗凝全血，組織樣設(shè)備：EP管、微量取液器(20l, 200l, 1000l)， 臺式高速離心機， 渦旋振蕩器試劑：裂解液 lysis buffer（40m

11、MTris-醋酸，20mM醋酸鈉, 1mMEDTA, 1%SDS, pH8.0）、Tris-飽和酚、氯仿、異戊醇、 NaAC 、RNA酶、無水乙醇、滅菌水 第21頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一1）在500l抗凝血中加入lysis buffer 1000l，充分顛混至清亮。以4000rpm，離心5min。棄上清液。 2）沉淀中加入lysis buffer 1500l，充分勻漿。以6000rpm，離心5min 。3）徹底棄去上清，加入extraction buffer 500l（裂解細胞），混勻置于37，水溶1h 。4）加入8l的蛋白酶 K，顛混，37過夜（或55，3h

12、，但是37效果要好些）。 5）每管加入450l飽和酚（取溶液下層）緩慢搖晃10min，以5500rpm，離心15min。2. 操作步驟（血樣）第22頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一6）取上清，每管加入250l飽和酚和250l氯仿異戊醇（24：1），搖勻10min，以5500rpm，離心15min。7）取上清，每管加入500l氯仿異戊醇，搖勻10min，以5500rpm，離心15min。8）取上清，每管加50l的3M的NaAC，適量無水乙醇（預(yù)冷）至滿，搖勻放入-20保存2h以上。 9）以12000rpm，離心20min。去上清，加入70乙醇500l，以12000rpm

13、，離心5min，去上清，5060干燥。10）加入50l滅菌去離子水，轉(zhuǎn)彈，混勻。 第23頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一3. 注意事項材料準(zhǔn)備最好使用新鮮材料，低溫保存的樣品材料不要反復(fù)凍融提取血液基因組DNA時，要選擇有核細胞（白細胞）細胞培養(yǎng)時間不能過長，否則會造成DNA降解含病毒的液體材料DNA含量較少，提取前先富集第24頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一3. 注意事項細胞裂解材料應(yīng)適量，過多會影響裂解，導(dǎo)致DNA量少，純度低針對不同材料，選擇適當(dāng)?shù)牧呀忸A(yù)處理方式：植物材料液氮研磨動物組織勻漿或液氮研磨組培細胞蛋白酶K細菌溶菌酶破壁高溫溫

14、浴時，定時輕柔振蕩第25頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一3. 注意事項核酸分離、純化采用吸附材料吸附的方式分離DNA時，應(yīng)提供相應(yīng)的緩沖體系采用有機（酚/氯仿）抽提時應(yīng)充分混勻，但動作要輕柔離心分離兩相時，應(yīng)保證一定的轉(zhuǎn)速和時間針對不同材料的特點，在提取過程中輔以相應(yīng)的去雜質(zhì)的方法第26頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一3. 注意事項核酸沉淀、溶解當(dāng)沉淀時間有限時，用預(yù)冷的乙醇或異丙醇沉淀，沉淀會更充分沉淀時加入1/10體積的NaAc（pH5.2，3M），有利于充分沉淀沉淀后應(yīng)用70的乙醇洗滌，以除去鹽離子等晾干DNA，讓乙醇充分揮發(fā)（不要過分

15、干燥）若長期儲存建議使用TE緩沖液溶解TE中的EDTA能螯和Mg2+或Mn2+離子，抑制DNasepH值為8.0，可防止DNA發(fā)生酸解 第27頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一DNA中含有蛋白、多糖、多酚類雜質(zhì)DNA在溶解前，有酒精殘留，酒精抑制后續(xù)酶解反應(yīng)DNA中殘留有金屬離子重新純化DNA，去除蛋白、多糖、多酚等雜質(zhì)重新沉淀DNA，讓酒精充分揮發(fā)增加70乙醇洗滌的次數(shù)（2-3次）4. DNA提取常見問題問題一：DNA樣品不純，抑制后續(xù)酶解和PCR反應(yīng)。 原因?qū)Σ叩?8頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一材料不新鮮或反復(fù)凍融未很好抑制內(nèi)源核酸酶的

16、活性提取過程操作過于劇烈，DNA被機械打斷外源核酸酶污染DNA樣品反復(fù)凍融盡量取新鮮材料，低溫保存材料避免反復(fù)凍融液氮研磨或勻漿組織后，應(yīng)在解凍前加入裂解緩沖液在提取內(nèi)源核酸酶含量豐富的材料的DNA時，可增加裂解液中螯合劑的含量細胞裂解后的后續(xù)操作應(yīng)盡量輕柔所有試劑用無菌水配制，耗材經(jīng)高溫滅菌將DNA分裝保存于緩沖液中，避免反復(fù)凍融問題二：DNA降解對策 原因5. DNA提取常見問題第29頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一實驗材料不佳或量少破壁或裂解不充分沉淀不完全洗滌時DNA丟失盡量選用新鮮（幼嫩）的材料動植物要勻漿研磨充分；細菌、酵母裂解前先用生物酶或機械方式破壁高

17、溫裂解時，時間適當(dāng)延長（對于動物細胞、細菌可增加PK的用量）低溫沉淀，延長沉淀時間加輔助物，促進沉淀洗滌時，最好用槍頭將洗滌液吸出，勿傾倒問題三：DNA提取量少對策 原因5. DNA提取常見問題第30頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一Plasmid DNA Extraction (Midiprep).flvmRNA Extraction from Total RNA.flv第31頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一1材料： 組織或者細胞2. 方法： TRIzol法，試劑盒二. 動物基因組總RNA的提取第32頁，共52頁，2022年，5月20日，15

18、點30分，星期一 總RNA提取試劑盒亞硫氫胍，巰基乙醇，n-月桂肌氨酸：變性細胞內(nèi)及核蛋 白復(fù)合物，釋放RNA；有效抑制核酸酶。苯酚：氯仿：異戊醇（25：24：1）（pH4.7）：酸平衡苯仿可抽提去除雜物。DNA及蛋白沉淀到有機相，RNA留在水相。酸性有機溶劑的抽提可免除用氯化鋰選擇沉淀RNA。用鋰沉淀導(dǎo)致小于5.8sRNA的丟失，并不利于下游操作。乙酸鈉（pH4.0）：維持變性的細胞裂解液的pH值，及沉淀RNA。第33頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一1TRIzol試劑2氯仿3異丙醇475%乙醇（DEPC水配制）5DEPC水TRIzol法提取RNA試劑準(zhǔn)備:第34頁，

19、共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一操作步驟 TRIzol法（組織）戴一次性手套將組織樣品從液氮中取出，用干滅過的剪刀將樣 品外包裹用紗布及表層的肉樣剪掉，然后放入干滅過的研缽中，往研缽中倒入液氮，快速研磨成細末狀；用1ml一次性塑料吸頭挑取細末裝入滅過菌的7mL一次性塑料離心管中用電子天平進行稱量，每管中稱取0.2g樣品；往管中加入2 mL TRIZOL，用力振蕩后于15-30C溫育5min以裂解細胞，再加入0.4 mL三氯甲烷并劇烈振蕩15s后于15-30C溫育3min；第35頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一將離心管置于冷凍離心機2-4C 100

20、00rpm/min離心15min，小心吸取上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入等體積異丙醇，混勻后于15-30C溫育15min以沉淀總RNA；將離心管置于冷凍離心機2-8C 10000rpm/min離心15min，棄上清；加入2mL用冰預(yù)冷的 75%乙醇漂洗，2-8C 7000 rpm/min離心 5min，棄上清，于室溫干燥10min；加入適量DEPC處理水并于55-60C水浴 溫育10min以溶解總RNA，取適量用于 DU640核酸蛋白測定儀測定濃度。 余下總RNA樣品的水溶液須保存在-80C。 第36頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一 TRIzol法（細胞）將1mlTriz

21、ol加入1-5105細胞（6 孔板）中，室溫放置3min。 將全部溶液轉(zhuǎn)移到1.5ml離心管中，加入0.2ml氯仿，振蕩15s，靜置2min。4離心，12000g15min，取上清 液(約400ul)。 加入0.4ml異丙醇，將管中液體輕輕混勻，室溫靜置10min。 4離心，12000g10min，棄上清。 加入1ml75%乙醇，輕輕洗滌沉淀。4，7500g5min，棄上清。 晾干，加入適量的DEPCH2O溶解（65促溶10-15min）。 第37頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一提取RNA 過程中防止RNA酶的污染所采取的步驟處理RNA樣品時必需仔細小心，其程度取決于

22、樣品的用途和來源由于RNA酶存在于所有的生物中并且能夠抵抗諸如煮沸這樣的物理破壞，固此建立一個無RNA酶的環(huán)境對于制備優(yōu)質(zhì)RNA很重要對于制備mRNA來說這些預(yù)防措施尤其重要。第38頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一提取RNA 過程中防止RNA酶的污染所采取的步驟方案：1) 工作區(qū)域應(yīng)與進行普通微生物實驗的區(qū)域分離好，特別是那些用于細菌接種、培養(yǎng)基和試劑配制的區(qū)域，那些培養(yǎng)基和試劑用于從細菌和動物細胞中進行DNA的制備和操作。通常認為這些區(qū)域富含RNA酶。2) 如有可能，使用標(biāo)有“無RNA酶”的商品試管、吸頭、溶液和水。通常新的無菌處理過的塑料試管和吸管無RNA酶第39

23、頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一提取RNA 過程中防止RNA酶的污染所采取的步驟3) 雙蒸水(ddH2O)和溶液應(yīng)該用RNA酶的抑制劑DEPC(焦碳酸二乙酯)進行處理：每100mL溶液或水中加入0.1mL DEPC原液，放在搖床上充分混勻并在37下作用數(shù)小時。然后將溶液高壓滅菌15min使DEPC失活。4) 用分子級的試劑和DEPC處理過的水配制的溶液通常沒有RNA酶。5) 分離RNA以前，將一些實驗室玻璃制品置于烤箱在300 烘烤4h以滅活核酶。如有可能，將其他設(shè)備也滅菌處理。第40頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一提取RNA 過程中防止RN

24、A酶的污染所采取的步驟從組織中提取RNA則要注意： 動物器官的解剖器械 存放組織塊的玻璃器皿 凍存組織塊所用的器皿 組織器官的沖洗液人汗含有RNA酶，故在所有步驟中均應(yīng)戴手套并經(jīng)常更換。 周圍環(huán)境含有大量的微生物和氣霧，它們來自吸液操作或來自我們自己的呼吸?？赡茉斐蒖NA酶的污染一些組織像脾臟可能比其它組織含有更多的RNA酶。細菌比哺乳動物細胞中有更多的RNA酶。因此從這些細胞中制備RNA應(yīng)采取更嚴格的預(yù)防措施。分離后的RNA通過瓊脂糖凝膠電泳再經(jīng)溴化乙錠染色后便可檢查其是否完整。rRNA(18s和28s) 條帶模糊可能表明由RNA酶引起的RNA的降解。第41頁，共52頁，2022年，5月20

25、日，15點30分，星期一 注意事項1. 所有玻璃器皿均應(yīng)在使用前于180的高溫下干烤2hr或更長時間；2. 塑料器皿用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿沖洗；3. 有機玻璃的電泳槽等，可先用去污劑洗滌，雙蒸水沖洗，乙醇干燥，再浸泡在3% H2O2 室溫10min，然后用0.1% DEPC水沖洗，晾干；第42頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一4.配制的溶液應(yīng)盡可能的用0.1% DEPC，在37處理12hr以上。然后用高壓滅菌除去殘留的DEPC。不能高壓滅菌的試劑，應(yīng)當(dāng)用DEPC處理過的無菌雙蒸水配制，然后經(jīng)0.22m濾膜過濾除菌；5.操作人員戴一次性口罩、手套，實驗過程中手

26、套要勤換；6.設(shè)置RNA操作專用實驗室，所有器械等應(yīng)為專用。第43頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一RNA電泳檢測和定量 RNA電泳檢測 核酸濃度儀檢測第44頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一 RNA電泳檢測和定量 核酸濃度儀檢測純度： OD260/OD2801.8 濃度：稀釋倍數(shù)讀數(shù)比色皿需經(jīng)濃鹽酸：甲醇（1：1）溶液浸泡！第45頁，共52頁，2022年，5月20日，15點30分，星期一 RNA電泳檢測和定量 瓊脂糖電泳檢測 制備1.2%凝膠：將1.2g瓊脂糖溶于63mL DEPC處理水，冷卻至60C，加入20mL 5甲醛凝膠電泳緩沖液和17mL 37%甲醛，混勻后在通風(fēng)櫥內(nèi)灌制凝膠，于室溫放置30min，使凝膠凝固; 制備總RNA樣品：在一滅過菌的0.5mL的微量離心管中混合4.5L總RNA，2L 5甲醛凝膠電泳緩沖液，3.5L 37%的甲醛和10L去離子甲酰胺，于65C水浴溫育15min，冰浴冷卻，稍加離心使管內(nèi)液體集中于管底。往管中加入2L甲醛凝膠加樣緩沖液和1L 1mg/mL的