發(fā)酵知識課件

1、發(fā)酵知識熊滌生 2013年5月6日發(fā)酵的應(yīng)用1.在醫(yī)藥工業(yè)上：胰島素、干擾素、生長激素、抗生素和疫苗等多種醫(yī)療保健藥物。2.在食品工業(yè)上：含醇飲料、乳制品、調(diào)味品、添加劑等。3.在化學(xué)工業(yè)上：氨基酸、香料、生物高分子、酶、維生素和單細(xì)胞蛋白等。4.在農(nóng)業(yè)上：生產(chǎn)天然殺蟲劑、細(xì)菌肥料和微生物除草劑，食用菌及藥用真菌等。5.在環(huán)保方面：廢棄物的處理、環(huán)境凈化等。發(fā)酵工程： 是指采用工程技術(shù)手段，利用生物（主要是微生物）和有活性的離體酶的某些功能，為人類生產(chǎn)有用的生物產(chǎn)品，或直接用微生物參與控制某些工業(yè)生產(chǎn)過程的一種技術(shù)。注：現(xiàn)在廣義的發(fā)酵工程已包括了動物和植物細(xì)胞工程技術(shù)發(fā)酵： 復(fù)雜的有機(jī)化合物在

2、微生物的作用下分解成比較簡單的物質(zhì)。發(fā)酵工程： 是用來解決按發(fā)酵工藝進(jìn)行工業(yè)化生產(chǎn)的工程學(xué)問題的學(xué)科?？煞譃樯嫌?、中游和下游工程三個(gè)階段。并且這三個(gè)階段都有各自的工程學(xué)問題。上游工程：包括優(yōu)良菌株的選育（篩選、分離、改造、純化、鑒定），實(shí)驗(yàn)室階段的條件優(yōu)化（如培養(yǎng)基配比、培養(yǎng)T、pH等），菌種保藏、復(fù)壯。中游工程：也是狹義的發(fā)酵，指最適發(fā)酵條件下，在發(fā)酵罐中大量培養(yǎng)細(xì)胞和生產(chǎn)代謝產(chǎn)物的工藝技術(shù)：包括對原料和設(shè)施的滅菌技術(shù)（方法、時(shí)間、溫度）、空氣過濾技術(shù)（材質(zhì)、孔徑）、計(jì)算機(jī)控制技術(shù)（參數(shù)檢測、電磁閥開關(guān)控制、生產(chǎn)過程中相關(guān)數(shù)據(jù)的記錄等）、工藝放大技術(shù)（培養(yǎng)基成分替代變更、接種時(shí)間及數(shù)量的調(diào)整

3、、誘導(dǎo)物添加數(shù)量及誘導(dǎo)時(shí)間的確定等）。下游工程：指從發(fā)酵液中分離和純化產(chǎn)品的技術(shù)：包括固液分離技術(shù)（離心分離，過濾分離，沉淀分離等工藝），細(xì)胞破壁技術(shù)（超聲、高壓剪切、滲透壓、表面活性劑和溶壁酶等），蛋白質(zhì)純化技術(shù)（沉淀法、色譜分離法和超濾法等），產(chǎn)品的包裝處理技術(shù)（真空干燥和冰凍干事燥等），和廢物（廢水、廢氣、廢渣）處理技術(shù)。發(fā)酵下游工程發(fā)酵中游工程發(fā)酵上游工程工業(yè)發(fā)酵分類對氧需要或不需要培養(yǎng)基是液態(tài)或固態(tài)發(fā)酵是在培養(yǎng)基表面或深層發(fā)酵是間歇或連續(xù)的菌種是否被固定在載體上菌種是單一還是混合菌種好氧發(fā)酵厭氧發(fā)酵液態(tài)發(fā)酵固態(tài)發(fā)酵表面發(fā)酵深層發(fā)酵分批發(fā)酵連續(xù)發(fā)酵游離發(fā)酵固定化發(fā)酵單一純種發(fā)酵混合發(fā)酵

4、影響發(fā)酵過程的因素菌種無菌操作培養(yǎng)基設(shè)備過程控制發(fā)酵罐的基本條件（1） 發(fā)酵罐應(yīng)具有適宜的徑高比。罐身越高，氧的利用率越高。（2） 發(fā)酵罐能承受一定的壓力。（3）要保證發(fā)酵液必須的溶解氧。（4）發(fā)酵罐應(yīng)具有足夠的冷卻面積。（5） 發(fā)酵罐內(nèi)應(yīng)盡量減少死角，避免藏垢積污，滅菌能徹底，避免染菌。（6） 攪拌器的軸封應(yīng)嚴(yán)密，減少泄漏。四種好氧發(fā)酵罐比較機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐塔式發(fā)酵罐氣升式發(fā)酵罐自吸式發(fā)酵罐機(jī)械攪拌通風(fēng)式：直接通無菌空氣自吸式：利用攪拌旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生的抽吸力吸入空氣。它的攪拌器是一個(gè)空心葉輪，葉輪快速旋轉(zhuǎn)時(shí)液體由于離心作用而被甩出，并在葉輪空心部分形成負(fù)壓，從而將罐外的空氣吸到罐內(nèi)。氣升式：借

5、助在環(huán)流管底部的噴嘴將空氣以250-300/s的高速噴入環(huán)流管，使氣泡分散在培養(yǎng)基中。由于環(huán)流管內(nèi)部的液體溶有大量氣泡，其密度明顯小于反應(yīng)器主體中培養(yǎng)液的密度。塔式：利用通入培養(yǎng)液的無菌空氣泡上升來帶動液體運(yùn)動，產(chǎn)生混合效果的非機(jī)械攪拌式發(fā)酵罐。四種發(fā)酵罐補(bǔ)氣方式的不同機(jī)械攪拌通風(fēng)發(fā)酵罐大?。?0 L50000 L結(jié)構(gòu)：主要由罐體、控溫部分、攪拌部分、通氣部分、進(jìn)出料口、測量系統(tǒng)和附屬系統(tǒng)等組成。 罐體：承受的壓力至少在0.3MPa以上。 控溫部分：包括測溫的溫度傳感器及控溫的夾套或盤管。一般容積小于50000L的發(fā)酵罐采用外夾套作為傳熱裝置，容積大于50000L的發(fā)酵罐則采用立式蛇管作為傳熱

6、裝置。 通氣部分: 是從罐的底部向罐內(nèi)通入無菌空氣，一般入口處的壓力為0.1-0.2MPa ，罐頂部有空氣出口。 攪拌部分: 是由安裝在一根軸上的多個(gè)渦輪式攪拌漿組成的。它具備許多功能：使罐內(nèi)物料混合良好，便于營養(yǎng)吸收；可打碎氣泡，加強(qiáng)氧的傳遞效果；與擋板結(jié)合，消除中心漩渦；產(chǎn)生高剪切速度，有利于物料混合均勻。 注：擋板和罐壁之間應(yīng)有一定的空隙，以免出現(xiàn)死角并積垢。 進(jìn)出料口：是進(jìn)料和出料的裝置，同時(shí)還配有補(bǔ)料口裝置。 測量系統(tǒng)：包括溫度、酸度和溶解氧的數(shù)據(jù)監(jiān)控、傳感器和測量裝置發(fā)酵工藝流程準(zhǔn)備消毒滅菌接種培養(yǎng)補(bǔ)料放罐與清洗檢查與維護(hù)1.1 檢查使用條件 定期檢查公用工程配置與使用環(huán)境，使用前

7、檢查各管道和導(dǎo)線接插件的連接是否正確，有無松動、老化或斷裂。1.2 檢查發(fā)酵罐密封件密封情況 檢查罐蓋和罐體法蘭間及罐蓋上各接插口的橡膠墊圈是否完好與妥善放置，均勻擰緊罐蓋鎖緊螺栓與插口壓帽，關(guān)閉所有閥門；通入空氣，檢查有無漏氣。1.3 試運(yùn)轉(zhuǎn) 打開接種口蓋，向罐內(nèi)注入水，蓋上并旋緊接種口蓋；夾套中通入冷卻水，充滿水后關(guān)閉冷卻開關(guān)；罐體中通入空氣，使罐壓保持在0.12MPa；逐一檢查水泵、加熱器、攪拌電機(jī)、蠕動泵、電磁閥、照明燈等是否正常；校驗(yàn)pH和溶氧電極，設(shè)置溫度、轉(zhuǎn)速、pH、補(bǔ)料、消泡等參數(shù)，觀察每個(gè)參數(shù)的測量與控制是否正確；排放罐內(nèi)液體，排放罐內(nèi)氣體，關(guān)閉循環(huán)水泵。 注：開攪拌時(shí)應(yīng)使罐

8、內(nèi)裝有不少于1/3全容積的液體，以免攪拌漿因空載引起晃動，造成攪拌軸變形甚至引發(fā)意外。2 消毒滅菌2.1 配料 夾套中充滿水，標(biāo)定罐重；提前稱好培養(yǎng)基中各成分，用部分水溶解；關(guān)閉底閥，打開接種口蓋，從接種口向罐內(nèi)注入待消毒料液，根據(jù)罐重顯示數(shù)據(jù)加水至消前體積，攪拌均勻，關(guān)閉接種口，再適當(dāng)旋松。2.2 自動在位滅菌4 補(bǔ)料 準(zhǔn)備好所補(bǔ)物料，加入到補(bǔ)料瓶中，將針頭與補(bǔ)料瓶出料管用硅膠管可靠連接，并將針頭用紗布、牛皮紙按無菌消毒要求嚴(yán)密包扎，為防止消毒降溫時(shí)料液經(jīng)膠管溢出，需將膠管中間近料瓶端夾死。消毒滅菌，保壓結(jié)束降溫時(shí)注意不要泄壓過快，以免料液沖出造成污染。將準(zhǔn)備好的所補(bǔ)物料膠管放入相應(yīng)蠕動泵壓

9、槽中，設(shè)置好相應(yīng)的補(bǔ)料參數(shù)。開始補(bǔ)料前，松開近料瓶端的夾子，用酒精棉球擦拭補(bǔ)料口，點(diǎn)燃，迅速將針頭插入。注：因補(bǔ)酸堿時(shí)，發(fā)酵液實(shí)際pH與pH探頭探測的酸堿數(shù)有一定時(shí)間差，所以若設(shè)備自動調(diào)節(jié)酸堿，則常常超出設(shè)定值，須來回調(diào)動而造成酸堿浪費(fèi)，且影響工藝。5 放罐與清洗放罐：發(fā)酵完畢，將發(fā)酵液從底閥和取樣放料閥放出，按工藝要求另行處理。清洗：發(fā)酵罐清洗須嚴(yán)格按照設(shè)備清洗SOP進(jìn)行，清洗前小心取下pH電極和溶氧電極，將pH電極浸入3mol/L的KCl溶液中，溶氧電極浸入蒸餾水中。6 檢查與維護(hù)檢查：清洗完畢，一定要檢查各閥門及計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)是否如要求開關(guān)，各接口是否有泄漏等。維護(hù)：若發(fā)現(xiàn)問題，須及時(shí)處

10、理，并做好相應(yīng)記錄。溫度對發(fā)酵生產(chǎn)的影響總的來說，溫度的選擇根據(jù)菌種生長階段及培養(yǎng)條件綜合考慮，最終是為了獲得最大的發(fā)酵得率。溫度對發(fā)酵生產(chǎn)的影響1、溫度影響反應(yīng)速率 2、溫度影響發(fā)酵方向3、溫度影響基質(zhì)溶解度 4、溫度影響產(chǎn)物合成發(fā)酵過程引起溫度變化的因素發(fā)酵熱 發(fā)酵過程中所產(chǎn)生的熱量，叫做發(fā)酵熱。 Q發(fā)酵=Q生物+Q攪拌-Q蒸發(fā)-Q輻射生物熱 來源 ：微生物對營養(yǎng)物質(zhì)的分解所釋放的能量 影響因素：菌株培養(yǎng)基成分 發(fā)酵時(shí)期 pH對生長的影響機(jī)制對E合成的影響對E活性的影響對ATP生產(chǎn)率影響： 影響菌體細(xì)胞膜電荷狀況，引起膜的滲透性的變化，因而影響菌體對營養(yǎng)物質(zhì)的吸收和代謝產(chǎn)物的分泌。影響培養(yǎng)

11、基某些重要營養(yǎng)物質(zhì)和中間代謝產(chǎn)物的離解，從而影響微生物對這些物質(zhì)的利用 pH對產(chǎn)物合成的影響產(chǎn)物合成階段的最適pH值和微生物生長階段的最適pH往往不一定相同，這不僅與菌種特性有關(guān)，還取決于產(chǎn)物的化學(xué)特性。pH影響代謝方向：pH不同，往往引起菌體代謝過程不同，使代謝產(chǎn)物的質(zhì)量和比例發(fā)生改變。pH對微生物生長的影響調(diào)節(jié)PH方法配制合適的培養(yǎng)基，有很好的緩沖能力；發(fā)酵過程中加入非營養(yǎng)基質(zhì)的酸堿調(diào)節(jié)劑(NaOH、HCl、 CaCO3)；發(fā)酵過程中加入生理酸性或堿性基質(zhì)； 酸性基質(zhì)：銨鹽、糖、油脂、玉米漿(脫NH4) 堿性基質(zhì)：NO3鹽、有機(jī)酸鹽、有機(jī)氮、氨水、尿素 原則: 殘?zhí)歉邥r(shí)，不用糖調(diào)pH 殘N

12、高時(shí)，不用生理鹽調(diào)pHpH控制與代謝調(diào)節(jié)結(jié)合起來，通過補(bǔ)料來控制pH溶解氧控制的工藝方法供氧方面：提高氧分壓（氧分含量）改變攪拌轉(zhuǎn)速：通過改變KLa來提高供氧能力 提高通氣速率：但增加有上限，否則會引起“過載”、泡沫提高罐壓：但同時(shí)會增加CO2的溶解度，影響pH及可能會影響菌的代謝，增加對設(shè)備的強(qiáng)度要求。耗氧方面 限制性基質(zhì)的流加控制（補(bǔ)料控制）：在OTR一定情況下，控制基質(zhì)濃度，控制溶解氧補(bǔ)料對發(fā)酵生產(chǎn)的影響補(bǔ)料的目的解除基質(zhì)過濃的抑制解除產(chǎn)物的反饋抑制解除分解代謝物阻遏作用避免因一次性投糖過多造成細(xì)胞大量生長，耗氧過多而造成波谷現(xiàn)象。在生產(chǎn)上，補(bǔ)料還經(jīng)常作為糾正異常發(fā)酵的一個(gè)重要手段。補(bǔ)料的內(nèi)容補(bǔ)充微生物能源和碳源補(bǔ)充菌體所需要的氮源補(bǔ)充微量元素或無機(jī)鹽添加前體、誘導(dǎo)劑等 補(bǔ)料的原則就在于控制微生物的中間代謝，使之向著有利于產(chǎn)物積累的方向發(fā)展。泡沫對發(fā)酵生產(chǎn)的影響泡沫的產(chǎn)生通氣和攪拌代謝氣體的逸出存在穩(wěn)定泡沫的表面活性物質(zhì)泡沫的不利影響