柳茶多糖的分離純化及氣相色譜質譜分析

1、柳茶多糖的別離純化及氣相色譜-質譜分析【摘要】目的首次提取柳茶中的水溶性粗多糖并進展別離、純化及組成分析。方法柳茶經(jīng)熱水提娶乙醇沉淀、Sevag法去蛋白、H22脫色，逆向流水透析得多糖精制品。將精多糖衍生化后運用氣相色譜-質譜法對其化學成分進展分析。結果確定了柳茶中水溶性多糖分別由核糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖組成，其中以核糖、葡糖糖、半乳糖為主。結論該方法簡便、靈敏，可以準確測定出柳茶多糖中所含有的各種單糖?！娟P鍵詞】柳茶多糖;純化;氣相色譜-質譜;單糖Abstrat：bjetiveTislateandpurifytheater-slubleplysaharidefrLiuhaandanaly

2、zetheheialpsitinfliuha.ethdsTheliuhaasextratedinhtater，thentheplysaharideinthefiltrateasfratinallypreipitatedbyalhl，afterthattheprtEinsinthepreipitatedprdutererevedbySevagreagent，hydrgenperxidedelr，thehydrlysatefplysaharideasdialyzedbythereversefltgetthefineprdut.Finally，theheialpsitinsfthefineprdut

3、afterderivatizatinereexainedbythegashratgraphy-assspetretrianalysis.ResultsTheplysaharidesarepsedfribse，annse，gluseandgalatse.Theajrnsaharidepnentsareribse，galatseandgluse.nlusinTheethdreprtedinthispaperissiple，andanbeusedfranalysisfnsaharideshydrlyzedfrLiuhaplysaharide.Keyrds：Liuhaplysaharide;Purif

4、y;Gashratgraphy-assspetretry;nsaharide柳茶為藏族民間常用藥，以薔薇科(Rsaeae)鮮卑花屬(Sibiraea)植物窄葉鮮卑花Sibiraeaangustata(Rehd.)Hand-azz.和鮮卑花Sibiraealaeigata(L)axi.的枝葉及果序(帶果實的果枝)入藥，主要用于消食導滯、疏散風熱;據(jù)藏藥文獻記載，柳茶主治熱病和疫病1?，F(xiàn)藏族民間常作茶飲，治療食后腹脹等諸多原因引起的消化不良，每每見效。柳茶中除含有揮發(fā)油、微量元素外，通過實驗發(fā)現(xiàn)還含有豐富的多糖。多糖作為進步機體免疫功能的保健品已被許多人承受，但許多多糖產(chǎn)品僅僅停留在保健品階段，未

5、能開發(fā)成藥物，主要原因是多糖的別離純化困難，技術不過關。因此本文旨在對柳茶多糖的提娶純化、組分分析進展研究并對其營養(yǎng)保健功能進展討論，以期為柳茶的開發(fā)及其綜合利用提供參考。1儀器與材料1.1儀器UV-2450紫外分光光度計(日本島津);NE2155電子天平(德國賽多利斯儀器公司);Agilent5793I-6890氣相色譜-質譜聯(lián)用儀(G-S);SE-54彈性石英毛細管柱(500.25id0.50);高純氦(純度99.999%);旋轉蒸發(fā)儀(上海青浦瀘西儀器廠)。1.2材料鮮卑花屬植物葉采自甘肅省甘南藏族自治州合作市郊，海拔3200以上。經(jīng)蘭州大學藥學院生藥學研究所楊永建教授鑒定其為薔薇科(R

6、saeae)鮮卑花屬(Sibiraea)植物窄葉鮮卑花Sibiraeaangustata(Rehd.)Hand-azz.和鮮卑花Sibiraealaeigata(L)axi.的葉。單糖標準品葡糖糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖標準品(Fluka公司)，鹽酸羥胺、吡啶、三氟乙酸、乙酸酐、氯仿以及其他試劑等均為國產(chǎn)分析純，蒸餾水為實驗室自制。2方法2.1多糖的提取與純化2.1.1粗多糖的提取取一定量的柳茶依次用石油醚、乙醚除去脂溶性雜質。加10倍量的水90100提取3次，3h/次，合并水提液，過濾。70水浴減壓濃縮至適量，參加5倍量95%的乙醇純析，靜置過夜，離心過濾，置真空冷凍枯燥

7、得柳茶多糖粗品。2.1.2粗多糖純化2將多糖粗品溶于蒸餾水，去不溶物，按Sevag法(氯仿正丁醇=41)脫蛋白，重復10次以上，然后移至透析袋中用去離子水逆流透析24h，直至紫外光譜分析檢測無蛋白吸收。以氨水調節(jié)pH為8，滴加H22，50保溫脫色2h，減壓濃縮，參加5倍量的無水乙醇，靜置過夜，離心搜集沉淀，將沉淀依次用無水乙醇、丙酮、乙醚漂洗2次，冷凍枯燥得去蛋白多糖純品。2.1.3紫外光譜分析取柳茶多糖適量，加水溶解，配制成濃度為1.0g/L的多糖水溶液，采用紫外可見分光光度法190700n范圍內掃描。光譜顯示柳茶多糖具有多糖特征性的紫外吸收圖譜僅在200n處有一銳細吸收峰，大于250n無明

8、顯的紫外吸收，是平坦的背景。結果說明，提取純化的多糖中不含有核酸、蛋白質以及其他雜質成分。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.2.2柳茶多糖的氣相色譜質譜測定2.2.1供試品溶液(糖腈乙酰酯衍生物)的制備稱取20g柳茶純化多糖樣品溶于2l21/L的TFA中，封管，于100水解6h，減壓除盡TFA。在水解產(chǎn)物中參加20g鹽酸羥胺和1l吡啶，封管于90反響30in。冷至室溫，再參加1l乙酸酐，封管于90反響30in，冷卻后轉出上層清液，減壓濃縮至干。滴入0.5l氯仿溶解后進展氣相色譜質譜分析。2.2.2對照品溶液的制備精細稱取單糖標準品葡糖糖、阿拉伯糖、核糖、甘露糖、木糖、果糖、半乳糖對照品20g，采用上述方法

9、制備乙?；苌?，氯仿溶解后進展氣相色譜質譜分析。2.3G-S分析條件2.3.1色譜條件SE-54毛細管柱，氣化室溫度270，柱前壓17.8kPa，分流比301，采用恒流形式載氣He流量1.2l/in，進樣量1l，程序升溫：起始溫度100保持6in，以20/in升至220保持14in，以5/in升至290。2.3.2質譜條件電子轟擊源(Ei)，電子能量70eV;離子源溫度：230;四極桿溫度：150;傳輸桿溫度：280;掃描范圍：14400au。3結果3.1單糖標準品和柳茶多糖的GS分析3.1.1混合單糖標準品乙酰化衍生物的總離子流圖見圖1。根據(jù)單糖標準品的乙?；苌锏腉-S的總離子流圖，確

10、定7種混合單糖標準品的G一S總離子流圖的出峰順序為果糖、核糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖。3.1.2柳茶多糖的乙酰化衍生物的總離子流圖見圖2。根據(jù)柳茶多糖的總離子流圖，通過各峰的保存時間和標準質譜尼斯特譜庫(NIST)對照分析可以確定其含有核糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖，出峰時間及其組成含量見表1。4討論分析多糖中單糖組成，首要的工作就是將多糖樣品進展徹底的水解。因為假如水解效果不理想，多糖很難完全水解為單糖或者僅僅有很少局部水解，導致樣品水解衍生化產(chǎn)物在氣相色譜分析中峰值很小，從而影響多糖中含量較少的單糖測定。通過對影響水解效果的各種因素的綜合考察分析，得出對于柳茶多糖的水解應采用

11、2l21/L的TFA水解6h較為適宜。在此水解條件下，可以使多糖較為完全地水解。而硫酸也可用于多糖的水解，但實驗時采用低濃度的硫酸水解時效果不理想，高濃度的硫酸那么易造成多糖的碳化。且由于硫酸沸點比擬高，水解后殘留的酸不容易揮發(fā)除去，必須用碳酸鋇中和處理，容易造成樣品組分的損失。表1柳茶多糖中的單糖含量柳茶多糖在空氣中提取或枯燥時顏色會加深，可用過氧化氫或活性炭脫色，活性炭在脫色時使用量大，樣品損失較多，故采用H22脫色。在用過氧化氫脫色處理后，一定要透析至無過氧化氫檢出，H22檢出用高錳酸鉀法。此外，在醇洗及醚洗、抽濾時用薄膜蓋住樣品，可減少空氣接觸，防止顏色加深。在脫色時50保溫脫色2h，時間短色素太多影響檢測結果，時間長也沒有更好的脫色效果。柳茶中除含有揮發(fā)油、微量元素、三萜類化合物等多種化學成分外，課題組發(fā)現(xiàn)其所含多糖也是其主要活性成分之一;多糖作為藥物應用是在20世紀40年代，自20世紀60年代以來，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)多糖具有更多的生物活性。不僅具有免疫調節(jié)功能，還可以抗感染、降血糖和抗腫瘤等，隨著多糖類化合物研究的深化，其在抗腫瘤和病毒的臨床治療方面顯示了