食品中蛋白質含量的測定

1、蛋白質測定意義 蛋白質是食品中主要營養(yǎng)指標。各種不一樣食品中蛋白質含量各不相同，普通說動物性食品蛋白質含量高于植物性食品，測定食品中蛋白質含量，對于評價食品營養(yǎng)價值、合理開發(fā)利用食品資源、提升產品質量、優(yōu)化食品配方、指導經濟核實及生產過程控制均含有極主要意義。蛋白質測定方法 蛋白質測定最慣用方法是凱氏定氮法，它是測定總有機氮最準確和操作較簡便方法之一,應用普遍。另外，雙縮脲分光光度比色法、染料結合分光光度比色法、酚試劑法等也慣用于蛋白質含量測定，因為方法簡便快速，多用于生產單位質量控制分析。近年來，國外采取紅外檢測儀對蛋白質進行快速定量分析。第1頁一、凱氏定氮法 新鮮食品中含氮化合物大多以蛋白

2、質為主體，所以檢驗食品中蛋白質時，往往測定總氮量，然后乘以蛋白質換算系數，即可得到蛋白質含量。凱氏定氮法可用于全部動物性、植物性食品蛋白質含量測定，因為樣品中含有少許核酸、生物堿、含氮類脂、卟啉以及含氮色素等非蛋白質含氮化合物，故此法結果稱為粗蛋白質含量。 該法分常量法、微量法、改良凱氏定氮法、自動定氮儀法、半微量法等各種方法。第2頁1、常量凱氏定氮法原理 將樣品與濃硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，其中C和H被氧化為CO2和H2O逸出，而樣品中有機氮轉化為NH3，并與H2SO4結合成NH4SO4，此過程稱為消化。加堿將消化液堿化，使NH3游離出來，再經過水蒸氣蒸餾，使NH3蒸出，用硼酸

3、吸收形成硼酸銨，再以標準鹽酸或硫酸溶液滴定，依據標準酸消耗量可計算出蛋白質含量。第3頁適用范圍 此法可應用于各類食品中蛋白質含量測定。試劑 濃硫酸 硫酸銅 硫酸鉀 氫氧化鈉溶液：400g/L硼酸吸收液：40g/L，稱取20g硼酸溶解于500mL熱水中，搖勻備用。 HCl標準溶液：0.1000mol/L。 甲基紅-溴甲酚綠混合指示劑：5份2g/L溴甲酚綠95%乙醇溶液與1份2g/L甲基紅乙醇溶液混合均勻。第4頁主要儀器 如圖，凱氏燒瓶（500mL)定氮蒸餾裝置。第5頁 準確稱取固體樣品0.202.00g（半固體樣品2.005.00g，液體樣品10.0025.00mL），小心移入干燥潔凈500mL

4、凱氏燒瓶中，加入研細0.2g硫酸銅、6g硫酸鉀及20ml濃硫酸，小心搖勻后，按圖安裝消化裝置，瓶頸45角傾斜置電爐上，在通風櫥內加熱消化）。樣品消化 先以小火遲緩加熱，待內容物完全炭化、泡沫消失后，加大火力保持瓶內液體微沸，消化至溶液呈藍綠色透明后，再繼續(xù)加熱微沸0.5h，取下冷卻，小心加入20mL水，移入100mL容量瓶中，用少許水洗定氮瓶，并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。同時做試劑空白試驗。第6頁 蒸餾、吸收 按圖裝好蒸餾裝置，在水蒸氣發(fā)生瓶內加入100mL蒸餾水約2/3處、玻璃珠數粒，加甲基紅指示液數滴及數毫升硫酸，以保持水呈酸性，加熱煮沸水蒸氣發(fā)生瓶內水。塞緊瓶口，冷凝管下端插入

5、吸收瓶液面下（瓶內預先裝有10mL 20gL硼酸溶液及混合指示劑12滴）。準確吸收10mL樣品處理液由小漏斗流入反應室，并以10mL水洗滌小燒杯使之流入反應室內，塞緊玻璃塞。從安全漏斗中慢慢加入10mL400g/L氫氧化鈉，溶液應呈藍褐色。不要搖動，將定氮球連接好。用直火加熱蒸餾30min，將蒸餾裝置出口離開液面繼續(xù)蒸餾1min，用蒸餾水淋洗尖端后停頓蒸餾。第7頁滴定： 將接收瓶內硼酸液用0.1000mol/L鹽酸標準溶液滴定至灰色或藍紫色為終點。同時做一試劑空白（除不加樣品，從消化開始操作完全相同）。結果計算式中-蛋白質含量，g/100g；c-硫酸或鹽酸標準溶液濃度，mol/L；V1-滴定樣

6、品吸收液時消耗鹽酸標準溶液體積，mL；V2-滴定空白吸收液時消耗鹽酸標準溶液體積，mL；m-樣品質量g，g；0.0140-1.0mL1.000mol/L硫酸（1/2H2SO4）或鹽酸標準溶液相當氮質量， g/mmol ；F-氮換算為蛋白質系數。第8頁2、微量凱氏定氮法原理 同常量凱氏定氮法。主要儀器 凱氏燒瓶（100mL）微量凱氏定氮裝置（如圖）試劑 0.01000mol/L鹽酸標準溶液，其它試劑同常量凱氏定氮法。第9頁操作方法 樣品消化：樣品消化步驟同常量法。將消化完全消化液冷卻后，完全轉入100mL容量瓶中，加蒸餾水至刻度，搖勻。 蒸餾：按圖裝好微量定氮裝置，準確量取消化稀釋液10mL于反

7、應管內，經漏斗再加入10mL400g/L氫氧化鈉溶液使呈強堿性，用少許蒸餾水洗漏斗數次，夾好漏斗，進行水蒸氣蒸餾。冷凝管下端預先插入盛有10mL40g/L（或20g/L）硼酸吸收液液面下。蒸餾至吸收液中所加混合指示劑變?yōu)榫G色開始計時，繼續(xù)蒸餾10min后，將冷凝管尖端提離液面再蒸餾1min，用蒸餾水沖洗冷凝管尖端后停頓蒸餾。餾出液用標準溶液滴定至微紅色為終點。同時做一空白試驗。第10頁 凱氏定氮法是各種測定蛋白質含量方法基礎，但操作費時，且在操作中會產生大量有害氣體而污染工作環(huán)境，影響操作人員健康。而分光光度測定法不但能滿足對工藝過程快速控制分析，而且含有環(huán)境污染少，操作簡便省時等特點?；驹?/p>

8、理：食品與硫酸和催化劑一同加熱消化，使蛋白質分解，分解氨與硫酸結合生成硫酸銨，然后在pH=4.8乙酸鈉-乙酸緩沖溶液中，銨與乙酰丙酮和甲醛反應生成黃色3,5-二乙酰-2,6-二甲基-1,4-二氫化吡啶化合物。在波長400nm處測定吸光度，與標準系列比較定量，結果乘以換算系數，即為蛋白質含量。二、蛋白質分光光度測定法第11頁試劑 氫氧化鈉溶液：300g/L。 乙酸：1mol/L。對硝基苯酚指示劑溶液：乙酸鈉-乙酸緩沖溶液：pH=4.8。顯色劑：15mL37%甲醛與7.8mL乙酰丙酮混合，加水稀釋至100mL,猛烈振搖，混勻（室溫下放置穩(wěn)定3日）。主要儀器：分光光度計；電熱恒溫水浴鍋（1000.5

9、）；10mL具塞玻璃比色管。第12頁氨氮標準貯備溶液：1.0g/L。精密稱取105干燥2h硫酸銨0.472g，加水溶解后移入100mL容量瓶中，并稀釋至刻度，混勻。此溶液每升相當于1.0mgNH3-N（10下貯存穩(wěn)定1年以上）氨氮標準使用溶液：0.1g/L。用移液管精密吸收10mL氨氮標準貯備溶液（1.0mg/mL）于100mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。此溶液每毫升相當于100gNH3-N。第13頁操作方法精密稱取經粉碎混勻過40目篩固體試樣0.10.5g或半固體試樣0.21.0g，或吸收液體試樣15mL，移入干燥100mL或250mL定氮瓶中，加0.1g硫酸銅、1g硫酸鉀及5mL硫酸，

10、搖勻后于瓶口放一小漏斗，將瓶以45斜支于有小孔石棉網上。小心加熱，待內容物全部炭化、泡沫完全停頓后，加強火力，并保持瓶內液體微沸，至液體呈藍綠色澄清透明后，再繼續(xù)加熱0.5h。取下放冷，小心加入20mL水，放冷后移入50mL或100mL容量瓶中，并用少許水洗定氮瓶，洗液并入容量瓶中，再加水至刻度，混勻備用。取與處理試樣相同量硫酸銅、硫酸鉀、硫酸按同一方法做試劑空白試驗。第14頁精密吸收25mL試樣或試劑空白消化液于50mL或100mL容量瓶內，加12滴對硝基苯酚指示劑溶液（1g/L），搖勻后滴加氫氧化鈉溶液（300g/L）中和至黃色，再滴加乙酸（1mol/L）至溶液無色，用水稀釋至刻度，混勻。

11、精密吸收0.0mL、0.05mL、0.1mL、0.2mL、0.4mL、0.6mL、0.8mL、1.0mL氨氮標準使用溶液（相當于0.0g、5.0g、10.0g、20.0g、40.0g、60g、80.0g、100.0gNH3-N），分別置于10mL比色管中。加4mL乙酸鈉-乙酸緩沖溶液（pH=4.8）及4mL顯色劑，加水稀釋至刻度，混勻，置于100水浴中加熱15min。取出用水冷卻至室溫后，移入1cm比色皿內，以空白為參比，于400nm波優(yōu)點測量吸光度，依據標準各點吸光度繪制標準曲線。第15頁精密吸收0.52.0mL（約相當于氮小于100g）試樣溶液和同量試劑空白溶液，分別于10mL比色管中。加4mL乙酸鈉-乙酸緩沖溶液及4顯色劑，加水稀釋至刻度，混勻，置于100水浴中加熱15min。取出用水冷卻至室溫后，移入1cm比色皿內，以空白為參比，于波長400nm處測量吸光度。試樣吸光度與標準曲線比較定量求