感染性疾病的分子診斷

1、DNAmRNA蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)錄反轉(zhuǎn)錄 翻譯 核酸分子雜交 基因結(jié)構(gòu)異常基 因 表 達 異 常PCR DNA測序 核酸分子雜交 實時熒光定量PCR 反轉(zhuǎn)錄PCR 蛋白質(zhì)芯片 ELISA 蛋白組織化學染色 Western-blot 基因芯片 基因診療技術和方法第1頁第2頁 第四代：分子診療（1978年始） 病因?qū)W診療 分子診療第3頁第4頁基因病類型1、感染性疾?。?病原生物侵入如流感、肝炎、艾滋病2、遺傳性疾?。?如苯丙酮尿癥、血友病等3、復雜性疾病，如腫瘤、原發(fā)性高血壓 第5頁第6頁感染性疾病的分子診斷嚴永敏 基礎醫(yī)學與醫(yī)學技術學院第7頁第一節(jié)診療策略及診療方法標本處理病毒基因檢測病原菌基因檢測第8頁

2、普通性檢出策略和方法 針對特異性核酸序列進行核酸分子探針雜交，或者利用常規(guī)PCR技術直接檢出微生物DNA/RNA，判斷有沒有感染和是何種病原體感染。完整檢出策略和方法 按照診療分型亞型耐藥性檢測思緒，利用各種基因診療伎倆對感染性病原體進行分析。一、分子診療策略第9頁二、分子診療方法1.信號放大技術（bDNA雜交捕捉系統(tǒng)）支鏈DNA（bDNA）技術第10頁雜交捕捉系統(tǒng)特點：穩(wěn)定性、重復性、特異性好第11頁二、分子診療方法2.靶分子擴增技術（PCR/TAS/LCR）轉(zhuǎn)錄依賴擴增系統(tǒng)（TAS）第12頁連接酶鏈反應（LCR）特點：簡單、快速、靈敏度高第13頁1.標本選擇選擇標準：符合疾病發(fā)病機制，反應

3、病程標本類型：血漿、血清、全血或白細胞核酸類型：DNARNAmiRNA三、標本處理2.標本量、抗凝劑3.標本保留、傳送4.標本預處理第14頁1.陰性結(jié)果注意：靈敏度,核酸提取及擴增效率.四、結(jié)果解釋2.陽性結(jié)果3.定性檢測結(jié)果4.疾病情況判斷注意：特異性,可能污染.注意：病情緩解患者.第15頁1.填補血清學診療缺點注意：窗口期,靈敏度,部分特殊病例.五、應用及評價2.不能培養(yǎng)或生長遲緩微生物3.監(jiān)測疾病狀態(tài)4.耐藥性及分型檢測第16頁第二節(jié) 病毒基因檢測乙型肝炎病毒（HBV）、人乳頭瘤病毒（HPV）：其DNA能夠使用點雜交、PCR方法直接檢出。丙型肝炎病毒（HCV）、人免疫缺點病毒（HIV）：

4、其RNA能夠使用RT-PCR方法直接檢出。第17頁HBV基因組結(jié)構(gòu)pre-s1pre-s2SPCpre-cX乙 肝pre-S1 pre-S1蛋白pre-S2 pre-S2蛋白S HBsAgpre-C HBeAgC HBcAgP DNAPX HBxAg乙型肝炎病毒基因結(jié)構(gòu)模式分子診療：信號放大技術；PCR法；耐藥性檢測第18頁1.填補血清學檢測結(jié)果,診療HBV臨床意義2.縮小窗口期,快速診療3.定量檢測,指導病情4.檢測耐藥,指導用藥第19頁丙型肝炎(HCV)基因診療實例丙型肝炎為RNA病毒，9500mer，編碼3011-3033個氨基酸，含有高變異性?；蚪M組成：E1NS2NS3NS43-NC

5、RCNS1/E2NS5B5-NCR高變異區(qū)（編碼衣殼和包膜蛋白）（NCR: 非編碼區(qū)） 5-NCR為保守區(qū)域，將引物設計在該區(qū)域，進行RT-PCR, 可特異性擴增HCV。第20頁分子檢測方法：1.HCVRNA定性及定量檢測 RT-PCR, 巢式PCR,定量PCR,轉(zhuǎn)錄依賴 擴增系統(tǒng)（如TAS）,分支DNA(bDNA) 2. HCV基因分型判定測序、real-time PCR等 第21頁第22頁第23頁1.監(jiān)測臨床療效臨床意義2.縮小窗口期,快速診療3.定量檢測4.免疫缺點補充檢測第24頁H1N1甲型流感第25頁 試驗室檢驗外周血象：白細胞總數(shù)普通不高或降低。重癥患者多有白細胞總數(shù)及淋巴細胞降低

6、，并有血小板降低；血清學診療：可使用間接ELISA、抗原捕捉ELISA、熒光免疫法等； 分子診療？第26頁分子診療策略第27頁第三節(jié) 病原菌基因檢測耐藥菌株監(jiān)測: 結(jié)核分支桿菌耐藥基因rpoB金黃色葡萄球菌耐藥基因MRSA第28頁確認歸于此次暴發(fā)最早病例：9月1日至年2月22日，發(fā)覺651例，來自43個州，死亡8例病例-對照調(diào)查：與花生醬相關，尤其一些花生醬餅干流行病學和試驗室調(diào)查發(fā)覺源頭為一個工廠生產(chǎn)花生醬和花生糊，這些產(chǎn)品同時也是多家食品生產(chǎn)廠家中間材料?；ㄉu污染造成鼠傷寒沙門菌沙門菌暴發(fā)，美國，-第29頁確認歸于此次暴發(fā)最早病例：9月1日至年2月22日，發(fā)覺651例，來自43個州，死亡

7、8例病例-對照調(diào)查：與花生醬相關，尤其一些花生醬餅干流行病學和試驗室調(diào)查發(fā)覺源頭為一個工廠生產(chǎn)花生醬和花生糊，這些產(chǎn)品同時也是多家食品生產(chǎn)廠家中間材料。花生醬污染造成鼠傷寒沙門菌沙門菌暴發(fā)，美國，-第30頁凍肉、蛋品、乳品及其它加工食品鮮肉、鮮蛋、鮮乳或其它未經(jīng)加工食品前增菌法25gBPW225mL36 1 普通4h，干蛋品18h24h10mLMM（或TTB）100mL10mLSC100mL直接增菌法25g滅菌生理鹽水25mL檢樣勻液25mL MM（或TTB）100mL檢樣勻液25mL SC100mLBSDHL（或HE、WS、SS）TSI（排除A/A H2S結(jié)果 ），靛基質(zhì)，尿素，KCN，賴氨酸沙門氏菌血清學試驗甘露醇 山梨醇H2S 靛 尿KCN 賴H2S 靛 尿KCN 賴/非如左述各種反應結(jié)果沙門氏菌血清學試驗 ONPG 沙門氏菌非沙門氏菌42 18h24h36 1 18h24h42 18h24h36 1 18