圖位克隆的基本原理和方法1課件

1、圖位克隆的基本原理和方法1圖位克隆的基本原理和方法1圖位克隆的基本原理其基本的原理是：功能基因在基因組中都有相對較穩(wěn)定的基因座，通過找到與目標性狀緊密連鎖的分子標記，在利用分子標記技術(shù)對目的基因精細定位的基礎(chǔ)上，由于水稻全基因組序列的發(fā)布，我們可以得到已定位區(qū)段的候選基因，通過對候選基因進行分析，確定目標基因，最后經(jīng)遺傳轉(zhuǎn)化試驗證實目的基因功能。圖位克隆的基本原理其基本的原理是：圖位克隆的步驟： Primary mappingFine mapping Candidate geneComplementation testFunctional analysis圖位克隆的步驟： Primary ma

2、ppingFinePrimary mappingprimary mapping method and Mapping population Primary mappingprimary mappi作圖群體將純合突變體與ZS97進行雜交，對雜交的種子進行基因型鑒定，找到雜合型種子（即種子能夠發(fā)生分離），將雜合F1代種子種下去后就能得到F2代群體。作圖群體將純合突變體與ZS97進行雜交，對雜交的種子進行基因 R/Rr/rR/R R/rF2 R/r r/rF1 P1 純合突變體 P2ZS97 R/Rr/rR/R R/rF2 R/r r/rF1primary mapping method Bulked

3、 Segregment Analysis：群組分離分析法。原理是將分離群體(F2、BC1等)中的個體依據(jù)研究的目標性狀(如抗病、感病)分成兩組，每一組取樣8-15份，在每一組群體中將各個體DNA等量（等濃度等體積）混合，形成兩個DNA池(如抗病池和感病池)。同時需要構(gòu)建兩個親本（ZH11/ZS97）的BSA池。由于分組時僅對目標性狀進行選擇，因此兩個池間理論上就應(yīng)主要在目標基因區(qū)段存在差異。primary mapping method Bulked ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)HY1(W)HY1(M)HY2(W)HY2(M)HY3(W)HY3(M)HY5(W)HY5(M)ZH1

4、1ZS97HL15(W)HL15(M)ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)將構(gòu)建的BSA池分別用本室的255對在親本ZH11/ZS97間存在多態(tài)性的SSR標記進行PCR擴增，經(jīng)過跑PAGE膠找到與目標性狀緊密連鎖的標記。ZH11ZS97HL15(W)HL15(M)HY1(W)HY找到緊密連鎖的分子標記之后我們就要進行一個“陽性”檢測：即檢測這個找到的分子標記是不是真正的與目標性狀連鎖。我們對F2代群體中隨機選取一個200左右的小群體，將找到的分子標記分別擴增這些樣，看表型與基因型是否對應(yīng)。同時我們可以用這個小群體進行一個初步的基因定位。找到緊密連鎖的分子標記之后我們就要進行一個“陽性”

5、檢測：即檢Fine mapping一. 表型觀察二. 篩選交換單株三. 開發(fā)新的分子標記Fine mapping一. 表型觀察 R/Rr/rR/R R/rF2 R/r r/rF1 P1 純合突變體 P2ZS97 正常表型突變表型 R/Rr/rR/R R/rF2 R/r r/rF1ZH11：“A” ZS97：“B” 交換有兩種帶型：H和BZH11：“A” ZS97：“B” 單株 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10M1M2M3M4M5 H A A B H A A A A B H A A B A A A A A A A A A A A A A A A A A H A A A B H H A A

6、 A H H A A B B H B A基因和表型相對應(yīng)！單株 1 2 3 開發(fā)新的標記：新的SSR標記： /modules/redbtools/ssrscan.php，運行SSRScan就會得到該段序列的簡單重復(fù)序列。InDel/Caps標記：將要開發(fā)標記的日本晴區(qū)段序列與93-11做一個blast，選取插入或者缺失比較大的位點設(shè)計引物。SNPS標記:可以通過測序找到在ZH11/ZS97間存在單堿基差異的位點，或者找謝老師咨詢。開發(fā)新的標記：Candidate gene將最后精細定位區(qū)段在/cgi-bin/gbrowse/rice/中輸入定位區(qū)間的物理位置，即可顯示出候選基因。Candidate gene將最后精細定位區(qū)段在http圖位克隆的基本原理和方法1精細定位擴大群體，進行精細定位精細定位擴大群體，進行精細定位找到候選基因后可對候選基因進行分析以排除非目標基因，可以通過比較擴增，測序，表達量檢測及目標性狀相關(guān)的生化和生理途徑等方法來排除。當然最后要說明問題