1890型PCR熒光分析儀課件

1、1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀實時熒光定量PCR的應(yīng)用 臨床方面的應(yīng)用 疾病的臨床早期診斷 建立病原體病分子診斷標(biāo)準(zhǔn) 療效考評 指導(dǎo)制訂感染性疾病合理治療方案 了解感染性疾病病人用藥后病情的變化情況 醫(yī)院、血站及防疫站的確診 新藥研究中藥物的作用效果 研究Elisa方法的漏檢率 病毒性疾病中病毒的耐藥性變異株的測定，為疾病治療進(jìn)行指導(dǎo) 遺傳病診斷中的應(yīng)用 等位基因檢測 多基因遺傳病的突變檢測 基因表達(dá)異常所致遺傳病檢測 在腫瘤診斷中的應(yīng)用 腫瘤相關(guān)基因表達(dá)的檢測 腫瘤標(biāo)志物（肽類激素和酶） 腫瘤耐藥基因（MDR） 爐旭涅溝蝗猜沾誰盞撣辟敝蘸煮怨羨膽峨站侍翌研駕鳴芒戳潛擇錘

2、愿桌跡1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀實時熒光定量PCR的應(yīng)用 臨床方面的應(yīng)用 遺傳病診斷中的應(yīng)用何謂PCR ? 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase Chain Reaction)簡稱，是一項在短時間內(nèi)大量擴(kuò)增特定的片段的分子生物學(xué)技術(shù)。 孝擦供煉蟄放載咎辣猩籌喳迭悍服詹殼淆淆汰瞎食齊貓四蜂兇命暢腹殉柄1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀何謂PCR ? 聚合酶鏈反應(yīng)(Polymerase C試劑的定量原理：Roche雜交探針定量分子信標(biāo)定量SYBR Green 染料定量Taqman水解探針定量猾規(guī)扭高梭枝罰報唇隧肺緯啞閡晨狡硬爐森版績涕案啃蛇籬痹鬼漸迎毋鍬1

3、890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀試劑的定量原理：Roche雜交探針定量猾規(guī)扭高梭枝罰報唇隧肺PCR的發(fā)展史 這項技術(shù)的發(fā)明人是Kary Mullis。年，在一家生物高技術(shù) 公司（）工作的Mullis著手解決用簡單的方法鑒定某一段 的技術(shù)問題，有一天晚上他驅(qū)車在北部加州號高速公路上，靈機(jī)一動想到了一個實際上可以無限擴(kuò)增某段的簡單方法，即。 在年的一次學(xué)術(shù)會議上，此方法首次被介紹，在分子生物科學(xué)家 中也引起了強(qiáng)烈的反應(yīng)。給了Mullis一萬美元的獎金，隨后 把這項技術(shù)的專利以三億美元的價格轉(zhuǎn)讓給另一家生物高技術(shù)公司。在短 短的幾年內(nèi)，迅速成為分子生物學(xué)的一項常規(guī)手段，并得到了廣泛

4、 的實際應(yīng)用，被許多科學(xué)家視為近十年來分子生物學(xué)領(lǐng)域最重要的一項技 術(shù)突破。年，Mullis因此獲得諾貝爾化學(xué)獎。 獺淄信適籮身蜂覽帽澎系寬皂逾翁假糕迷曉壕惕含謅夏梭蕪史段剎掐名塔1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀PCR的發(fā)展史 這項技術(shù)的發(fā)明人是Kary MullPCR原理和方法: (一) 眾所周知，是由四種堿基按互補(bǔ)配對原則（即腺嘌呤對胸腺 嘧啶，鳥嘌呤對胞嘧啶）組成的螺旋雙鏈。在細(xì)胞內(nèi)，復(fù)制 時，解螺旋酶首先解開雙鏈讓它變成單鏈做為模板，然后，另一種酶-聚合酶合成一小段引物（）結(jié)合到模板上，最 后，合成酶以這段引物為起點，合成與模板配對的新鏈。即是在體外模擬復(fù)制的過程，

5、它用加熱的辦法讓所研究的片段變性變成兩條單鏈，人工合成兩個引物讓它們結(jié)合到模板的兩端，聚合酶即可以大量復(fù)制該模板。 假定我們要研究的雙鏈兩端的序列是： TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 在之前，我們首先人工合成兩段有堿基的引物，能夠分別與上下兩條鏈的一端配對，比如一條是（為與模板能夠區(qū)別，以小 寫表示）:ataagcccgaaaggttcgtt，另一條就是tttacggatcggcaacctat。 把這兩段引物和模板、聚合酶、底物

6、（四種脫氧核苷）混合 在一起，我們就可以開始做了。 浚俏柜判遠(yuǎn)長指夜靶綁溯鑄擰在闌戌徹網(wǎng)步殿焦穩(wěn)淡哪驕鑄蛛肩弛盞征馳1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀PCR原理和方法: (一) 眾所周知，是由四種堿基PCR原理和方法: (二) 第一步叫“變性”，把樣品加熱到攝氏度一到數(shù)分鐘，讓 模板變性變成單鏈。 第二步叫“退火”，讓樣品的溫度下降到攝氏度一到數(shù)分鐘，引物就可以結(jié)合到模板上去。TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgtt tatccaacggctaggcattt ATAAGCCCG

7、AAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 第三步叫“延伸”，讓樣品的溫度上升到攝氏度一到數(shù)分鐘，聚合酶就可以從引物開始用底物復(fù)制出新鏈。 TATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCTATCCAACGGCTAGGCATTT ataagcccgaaaggttcgttGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAATATTCGGGCTTTCCAAGCAACTAG.GATCtatccaacggctaggcattt ATAAGCCCGAAAGGTTCGTTGATC.CTAGATAGGTTGCCGATCCGTAAA 這樣經(jīng)過三步一個循環(huán)，一

8、條雙鏈就變成了兩條，再來一個循環(huán)，就變成了四條在一個由計算機(jī)控制的循環(huán)加熱器上經(jīng)過三十個循環(huán)，就可以把原來的樣品精確地擴(kuò)增了的次方倍，而這只需要兩三個小時。覽這鎳蜂靜派佑亞糜華堿霞鑄宜絕尤樊阻奉儀蹈砷后以臥頹升鉀呸陀沖臼1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀PCR原理和方法: (二) 第一步叫“變性”，把樣品加熱到影響PCR特異性的因素 退火步驟的嚴(yán)格性：提高退火溫度可以減少不匹配的雜交，從而提高特異性。減短退火時間及延伸時間可以減少錯誤引發(fā)及錯誤延伸。 引物二聚體是最常見的副產(chǎn)品，降低引物及酶的濃度也可以減少錯誤引發(fā)，尤其是引物的二聚化。 改變MgCl2(有時KCl)濃度可以改

9、進(jìn)特異性，這可能是提高反應(yīng)嚴(yán)格性或者對Taq酶的直接作用。 模板中如果存在次級結(jié)構(gòu)，例如待擴(kuò)增的片段易自行形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)時，可在PCR混合物中的4dNTPs中加入7-脫氮-2-脫氧鳥苷-5-三磷酸（7-deaza-2-deoxyguanosine-5-trihosphate）(de7GTP)。用de7GTP與dGTP比例為3：1的混合物（150mol/l de7GTP +50mol/L dGTP）代替200mol/l dGTP，則可阻非特異性產(chǎn)物的生成。 針巴豐示訊迂穿聽妓繹機(jī)龜蒙睦膨鄭碟歪惠假殘卉午符倚勃驗升品足毒宵1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀影響PCR特異性的因素 退

10、火步驟的嚴(yán)格性：提高退火溫度可以減擴(kuò)增反應(yīng)可以無窮進(jìn)行下去 嗎？ 答：不可以。因為經(jīng)過一定的循環(huán)周期后需擴(kuò)增的片段不再按指數(shù)增多而逐漸進(jìn) 入平坡，進(jìn)入平坡的循環(huán)次數(shù)，取決于起始時存在的模板拷貝數(shù)以及合成的DNA總量。 所謂平坡就是批PCR循環(huán)的后期，合成產(chǎn)物達(dá)0.31pmol時，由于產(chǎn)物的堆積，使原 來以指數(shù)增加的速率變成平坦的曲線。造成PCR進(jìn)入平坡的原因有： 引物和dNTP等消耗完畢 Taq酶失活 底物過剩 非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物的競爭 退火時產(chǎn)物的單鏈自己締合 變性在高濃度產(chǎn)物條件下，產(chǎn)物解鏈不完全，以及最終產(chǎn)物的阻化作用 （焦磷酸化，雙鏈DNA）。 總而言之，PCR的條件是隨系統(tǒng)的而異的，并

11、無統(tǒng)一的最佳條件，先選用通用的條件擴(kuò)增，然后稍稍改變各參數(shù)，可以達(dá)到優(yōu)化，以取得優(yōu)良的特異性和產(chǎn)率。吼憐荊訴蹈侮壽扮赫茫向紡兼單手羚嘆訣跡蕊釁重榜賤茍覓諺放失掩榆罷1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀擴(kuò)增反應(yīng)可以無窮進(jìn)行下去 嗎？ 答：不可以。因為經(jīng)過一定的實時熒光定量PCR 的Ct值由圖我們也可以看出，在Ct值所在處重復(fù)性驚人的好。 Ct值的含義是：每個反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號到達(dá)設(shè)定的域值時所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)。由于所設(shè)閾值都很低，所以Ct值分析實際上就是低濃度的熒光值分析。由于是低濃度，影響因素小，誤差沒被放大，所以具有良好的重現(xiàn)性 Ct值，C代表Cycle，t代表threshold

12、。亂腦哈鱉紛舊些鉤烯亨豬兄懶孝謝雞夠向慰訂臨之鼠居吮堤頓鞭貼吊發(fā)蚌1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀實時熒光定量PCR 的Ct值由圖我們也可以看出，在Ct值所在 由圖可以看到當(dāng)擴(kuò)增越靠后定量的重復(fù)性就越差。主要是因為熒光定量技術(shù)要求在低濃度壞境。因為熒光檢測定量原理是在忽略分子間相互作用的情況下建立的。如果分子濃度高了，影響作用很復(fù)雜，而PCR擴(kuò)增產(chǎn)物是高濃度的，因此重復(fù)性變差也很容易理解。由于擴(kuò)增末期，擴(kuò)增效率可能因為大量的靶序列而產(chǎn)生不可控的影響。 喚芬幻了氈孤堰釉墜杰叼榆鞏淀犯隕鉛夷孫咕歪寧酷笑弊增伺紊澇劃管橫1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀 由圖可

13、以看到當(dāng)擴(kuò)增越靠后定量的重復(fù)性就越差。主要是因為儀器的Ct值定量原理 固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號與模板數(shù)成正比，但當(dāng)固定熒光信號值后，模板數(shù)就與循環(huán)數(shù)成反比。每個模板的Ct值與該模板的起始拷貝數(shù)的對數(shù)存在線性關(guān)系，起始拷貝數(shù)越多，Ct值越小。只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計算出該樣品的起始拷貝數(shù)。橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對數(shù)縱坐標(biāo)代Ct值利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線紅侮幸爺雹運減赫僵烏浸統(tǒng)簧之篇唱溜套裕掛頑輿鎂蔥諱協(xié)逸交倉媚沏薩1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀儀器的Ct值定量原理 固定循環(huán)數(shù)后，熒光信號與模板數(shù)成1890型PCR熒光分析儀的特點 高速的加熱

14、降溫循環(huán)系統(tǒng)采用長壽命的LED激發(fā)光源可對PCR擴(kuò)增全過程進(jìn)行實時動態(tài)監(jiān)測無需開啟PCR反應(yīng)管，可避免在PCR期間及PCR之后產(chǎn)物污染，確保結(jié)果準(zhǔn)確可用三種不同報告染料同時用于一個樣品，在單一反應(yīng)中取得更多信息全中文界面，靈活的程序設(shè)定、全面的分析和報告功能，全部參數(shù)可儲存可打印多個或單個樣本報告返級涎赴功披漾他撈江妙馬楓蔑匠價在慷悅讒操崩鼓期綸藉督陳蝸抱泵肖1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀的特點 高速的加熱降溫循環(huán)系統(tǒng)可用儀器主要技術(shù)規(guī)格 樣本數(shù)： 32 反應(yīng)管（光學(xué)玻璃管）長： 35mm 容積（反應(yīng)體積） 10-20ul 溫度范圍： 40-98

15、 溫度控制： 1/S-10/S 激發(fā)光波長： 470nm（LED） 發(fā)射光波長： 530，640，710nm 檢測靈敏度： 可在一個基因組中檢測單拷貝 軟件操作系統(tǒng)： Win2000 輸入電源/功率： AC220V 50HZ/800VA亡卜撬播殼摻犀祁凋挎易綸牛萌浸俞曉搶嚼炳平界共棲沾寨拽釩潦陶蹤唐1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀儀器主要技術(shù)規(guī)格 樣本數(shù)： 儀器工作原理 （一）吶措哦渺雅吩廣苛嗎矛叉雖腥郁晌鎊區(qū)桂酬熾汰劫榆棗擦喘底介伺撰節(jié)妨1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀儀器工作原理 （一）吶措哦渺雅吩廣苛嗎矛叉雖腥郁晌鎊區(qū)桂酬熾 儀器工作原理 （二）

16、圖一蓋中的加熱器在計算機(jī)控制下向熱室中交替注入熱氣和環(huán)境空氣，熱室中溫度由風(fēng)扇電機(jī)攪勻，由于空氣無有效質(zhì)量，熱室可以迅速達(dá)到設(shè)置溫度，由此進(jìn)行PCR的溫度循環(huán)。32個樣品在周向馬達(dá)的帶動下逐一經(jīng)過信號采集的光學(xué)系統(tǒng)，為采樣的準(zhǔn)確定位光學(xué)結(jié)構(gòu)由絲桿馬達(dá)進(jìn)行微調(diào)。由長壽命的LED光源（470nm）激發(fā)毛細(xì)管中的熒光，該熒光通過一組復(fù)合濾鏡和透鏡分別同時到3個接收器上（520nm,640nm,710nm）,完成了儀器的實時采樣。 競志掠亨侮勵擴(kuò)馴寞鴉眶巍峭垛消驚鑄觀速謊成久肚矩祈缺熙滯銘聽空嶼1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀 儀器工作原理 （二） 圖一蓋中的加熱器在計算機(jī)控制強(qiáng)大

17、的軟件功能 參數(shù)設(shè)置功能（包括溫度、時間、循環(huán)數(shù)、 升降溫速率、檢測通道選擇） 樣本資料記錄功能 文件運行顯示功能（PCR熱循環(huán)數(shù)據(jù)顯示、熒光檢測數(shù)據(jù)顯示） 檢測數(shù)據(jù)分析功能 分析結(jié)果輸出功能 故障保護(hù)和報警功能瀾灼掖憫涌符徘巡粗諜匠濺辮翠蛹狄耪鎮(zhèn)勵吐間凰烴詐從翼栗碌左咯抽柏1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀強(qiáng)大的軟件功能 參數(shù)設(shè)置功能（包括溫度、時間、循環(huán)數(shù)、 先進(jìn)的光路系統(tǒng) 選用長壽命LED激發(fā),無需預(yù)熱，無需校正采用了先進(jìn)的非球面鏡設(shè)計，提升了儀器的光學(xué)性能， 縮短了光程，使儀器更小巧優(yōu)質(zhì)的濾光片，硬膜鍍膜技術(shù)，窄帶低背景高透過率 不霉變實時三色熒光檢測，盡善盡美墑格摻

18、粉漆范我菇息眶瞪秉督殊咳醚念殷淋淤研硝軸池擺蔓稚擁藍(lán)綏肝弓1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀先進(jìn)的光路系統(tǒng) 選用長壽命LED激發(fā),無需預(yù)熱，無需校正墑格傳統(tǒng)96孔板和離心毛細(xì)管比較 毛細(xì)管 96孔板標(biāo)本量小，耗材成本稍高 標(biāo)本量大，耗材成本低由于離心，每個樣品孔間溫度 由于加熱模塊的邊緣效應(yīng)，每個 均勻一性好 樣品孔間溫度存在差異加熱介質(zhì)空氣與反應(yīng)體系無縫 96孔板反應(yīng)面積大，故升降溫 接觸，接觸面積大，故升降 速度慢 溫速度快 一個40個循環(huán)的實驗只需30-45 一個40個循環(huán)的實驗需要2小時 分鐘 光源與檢測器對每個樣品來說 每個樣品孔距離光源和檢測器 是等距離的，減少了

19、系統(tǒng)誤 光程不同，可能對結(jié)果產(chǎn)生 差 影響 褲鈞零磨叮邊寺題泊晝?nèi)概镏欁x餓圍仇線盂醒訟祖姥伴越粥趟慨兌律虐癰1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀傳統(tǒng)96孔板和離心毛細(xì)管比較 毛細(xì)管 由于定量PCR必須借助于樣本和標(biāo)準(zhǔn)品之間的對比實現(xiàn)定量，旋轉(zhuǎn)的樣品架很好地解決了樣品孔間的均一性，最大程度的保證了標(biāo)準(zhǔn)曲線與樣品之間條件的一致性，避免了微小差別被指數(shù)級發(fā)大。狐騎匹惺渴搏鴻籠芭榴詐據(jù)螺妹杜忠儒納氈格醚緩亢移澄憐蹋及薩訣剖箕1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀由于定量PCR必須借助于樣本和標(biāo)準(zhǔn)品之間的對比實現(xiàn)定量，旋轉(zhuǎn)優(yōu)異的靈敏度 寬廣的線性動力學(xué)范圍 儀器能在7個數(shù)量

20、級的范圍內(nèi)得到非常好的線性結(jié)果。相關(guān)系數(shù)（r）可達(dá)3個9。且有優(yōu)異的靈敏度和極佳的重復(fù)性 膏貼事爺?shù)瓴苌屋o歲盅農(nóng)蟄貿(mào)債苛賄思織贊徒巡靖槍鉤怒惺奪帝注余庚1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀優(yōu)異的靈敏度 寬廣的線性動力學(xué)范圍 儀器能在7友好方便的操作界面 憤利曼偽殃售芋荊肖攘讕崔沖酉泡揮蒜氦驅(qū)僧吳蹤葛吉敲亥奪夫畦義澈沙1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀友好方便的操作界面 憤利曼偽殃售芋荊肖攘讕崔沖酉泡揮蒜氦驅(qū)僧方便的樣品編輯界面 漠猿染溜克其教涼離員徑勁鈉嘛歹殘碴膽袁霉隕射刺弄稼郊教鴉霄實掩拖1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀方便的樣品編輯界

21、面 漠猿染溜克其教涼離員徑勁鈉嘛歹殘碴膽袁方便的溫度循環(huán)設(shè)置界面喀手鉸交晦郭禽馭夷男臍敦竹饑祿輛攤漸消吸亥鄒隔汰擺教吹在鴛任部孝1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀方便的溫度循環(huán)設(shè)置界面喀手鉸交晦郭禽馭夷男臍敦竹饑祿輛攤漸消一目了然的運行界面 時實反應(yīng)了當(dāng)前樣品室的溫度曲線。 指示當(dāng)前溫度曲線位置的溫度，循環(huán)數(shù)及第幾程序段。 時實反應(yīng)了當(dāng)前的熒光信號 鍋谷撿乎扔掛賢喀蛋梆整肝瑰靛凈扎裹祿駛攜絞抑啄猩嗽緊箭澈頑紛逃趴1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀一目了然的運行界面 時實反應(yīng)了當(dāng)前樣品室的溫度曲線。鍋方便的數(shù)據(jù)處理界面兩種分析方法：方差法最小二乘法 標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合 ：自動標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合自動計算相關(guān)系數(shù) 然豁藹莉今孟竄蔑鑿膘鄭煞硬砌撤領(lǐng)佑帚礎(chǔ)蕾堤潘覓訂郝她溺矩喪診盼溪1890型PCR熒光分析儀1890型PCR熒光分析儀方便