電子顯微鏡樣品制備與觀察電子顯微鏡樣品制備課件

1、電子顯微鏡樣品制備與觀察電子顯微鏡樣品制備電子顯微鏡樣品制備與觀察電子顯微鏡樣品制備電子顯微鏡樣品制備與觀察河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院電子顯微鏡樣品制備與觀察河北大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院主要內(nèi)容樣品的取材與固定樣品的滲透與包埋修快與支持膜的制備玻璃刀的制作與超薄切片電子染色電子顯微鏡的使用與生物樣品超微結(jié)構(gòu)觀察主要內(nèi)容樣品的取材與固定一、樣品的取材與固定（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握電鏡樣品取材的方法與要求2 掌握電鏡樣品的固定方法與要求（二）實(shí)驗(yàn)原理（見原理部分）（三）實(shí)驗(yàn)材料小白鼠肝臟（等）一、樣品的取材與固定（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ㄋ模?shí)驗(yàn)方法1 動物麻醉 將小白鼠放入燒杯，放入一蘸有氯仿的脫脂棉球，用培養(yǎng)皿蓋住燒杯

2、口，約35min后小白鼠被麻醉；2 解剖分割 迅速解剖，取出肝臟，在硬紙上用新單面刀片分割成0.5*0.5*0.5mm3 小塊，迅速投入準(zhǔn)備號的固定液；3 前固定 2.5%戊二醛04固定12h（固定液需提前準(zhǔn)備號）；4 漂洗 0.1M磷酸緩沖液漂洗3次，每次510min,04；（四）實(shí)驗(yàn)方法5 后固定 1鋨酸固定12h，04；6 漂洗 0.1M磷酸緩沖液漂洗3次，每次510min,04；7 脫水 30乙醇 50乙醇 70乙醇，04，每步510min；8 保存 70乙醇04保存。5 后固定 1鋨酸固定12h，04；（五）實(shí)驗(yàn)要求1 用具干燥；2 取材 快、準(zhǔn)、小、輕；3 鋨酸有毒，需在通風(fēng)廚中進(jìn)

3、行，含鋨酸的廢液放入指定容器；4 每人固定23塊樣品；5 在固定的過程中要不斷震動樣品管。（五）實(shí)驗(yàn)要求二、樣品的滲透與包埋（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康恼莆粘∏衅瑯悠窛B透與包埋的方法（二）實(shí)驗(yàn)原理見理論部分（三）實(shí)驗(yàn)材料上次保存的材料二、樣品的滲透與包埋（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ㄋ模?shí)驗(yàn)方法1 脫水 85乙醇 95乙醇 100乙醇 100乙醇，每步510min；2 置換 丙酮丙酮，每步510min ；3 滲透 1/2丙酮+1/2環(huán)氧樹脂14h；4 包埋 先將包埋模塊加滿環(huán)氧樹脂，再將滲透過 的材料用牙簽挑到包埋模塊尖端部分，并在其中滲透34h；5 聚合 加熱37 45 60，各12h。（四）實(shí)驗(yàn)方法（五）實(shí)驗(yàn)要求1

4、 所用器具、工具保持清潔干燥；2 手上若沾有環(huán)氧樹脂，用丙酮棉球擦去；每人包埋23個樣品塊。（五）實(shí)驗(yàn)要求三、修快與支持膜的制備（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康? 掌握超薄切片包埋塊修快的方法；2 掌握支持膜制備的方法。（二）實(shí)驗(yàn)原理見理論部分（三）實(shí)驗(yàn)材料上次實(shí)驗(yàn)包埋的材料三、修快與支持膜的制備（一）實(shí)驗(yàn)?zāi)康模ㄋ模?shí)驗(yàn)方法1 修快（1）用樣品夾頭夾住環(huán)氧樹脂包埋塊的2/3左右，夾緊，或用手拿住樣品塊；（2）用小鋼銼或單面刀片修快使達(dá)到下面要求：切面光滑平整，盡可能是要觀察的材料，切面大小0.5*0.5mm2；34個斜面的坡度以45度為宜。（四）實(shí)驗(yàn)方法2 支持膜的制備（1）將玻璃條、250ml燒杯洗凈，玻璃條

5、先用紗布擦干，然后再用綢布用力反復(fù)擦凈，250ml燒杯裝滿蒸餾水；（2）將玻璃條放入0.20.3%聚乙烯醇縮甲醛的氯仿溶液中24cm深，停留35s后提出，在空氣中自然干燥；（3）在玻璃條四周用單面刀片將膜輕輕劃開，然后以與水面30度角緩慢插入放在日光燈正下方的250ml燒杯的蒸餾水中，同時(shí)用眼觀察(使眼正好能看到水面反射的日光燈的光線)，使膜完全脫離玻璃條而漂浮在水面上，膜應(yīng)為均勻的灰色（約15nm）；2 支持膜的制備（4）將24片載網(wǎng)放在膜上，再用鑷子輕壓12下，使載網(wǎng)與膜緊貼；（5）再用比膜稍大的濾紙放在膜的上方，輕壓下濾紙一角，在濾紙剛好全部濕潤之際將濾紙?zhí)崞穑d網(wǎng)與膜亦貼在濾紙上；（6

6、）將膜向上保存于培養(yǎng)皿中備用。（五）實(shí)驗(yàn)要求1 制膜所用的器具、蒸餾水、紗布、綢布必須干凈，用后洗凈，制膜過程要防塵；2 每人修快2塊，制膜2張，將修好的樣品塊用紙包好寫上組號姓名；3 預(yù)習(xí)下次實(shí)驗(yàn)。（4）將24片載網(wǎng)放在膜上，再用鑷子輕壓12下，使載網(wǎng)與四、玻璃刀的制作與超薄切片（一）玻璃刀的制作（二）超薄切片四、玻璃刀的制作與超薄切片（一）玻璃刀的制作五、電子染色1 蠟盤的制作 在培養(yǎng)皿中注入融化的石蠟，讓其逐漸凝固；2 滴加染液3 鈾染4 水洗5 鉛染6 水洗7 干燥五、電子染色1 蠟盤的制作 在培養(yǎng)皿中注入融化的石蠟，讓其六、電子顯微鏡的使用與樣品超微結(jié)構(gòu)觀察（一）JEM-100SX透

7、射電子顯微鏡的使用1 啟動：閉合電子顯微鏡穩(wěn)壓電源開關(guān)與冷卻循環(huán)水穩(wěn)壓電源開光，壓下啟動按鈕。約30分鐘后儀器進(jìn)入可工作狀態(tài)。2 放入樣品：按程序放入樣品。3 加高壓：有下列幾檔可選 40KV、60KV、80KV 、100KV，若需高壓應(yīng)先加低壓。選擇加速電壓原則：電壓越高，分辨率越高，反差越??；反之，電壓越低分辨率越低，反差越大。六、電子顯微鏡的使用與樣品超微結(jié)構(gòu)觀察（一）JEM-100S4 加燈絲電源：順時(shí)針旋轉(zhuǎn)至限位處（加燈絲電源必須有高壓存在），此時(shí)應(yīng)看到圖象，若不能看到圖象，請與專職人員聯(lián)系，切勿隨意調(diào)整各旋鈕。 5 觀察:調(diào)整放大倍數(shù)、亮度、樣品XY平移、焦距進(jìn)行觀察。6 照相：將要照相部位移至視野中心標(biāo)記方框內(nèi)，過卷，調(diào)整焦距、亮度至自動曝光兩個綠燈同時(shí)亮，抬起熒光屏進(jìn)行曝光。7 關(guān)機(jī)：將放大倍數(shù)調(diào)至1000X，調(diào)整亮度正好充滿熒光屏，取出樣品，燈絲旋鈕調(diào)至最低，高壓調(diào)至OFF，壓下關(guān)閉按鈕，約5分鐘后儀器關(guān)閉，切斷兩個穩(wěn)壓電源開關(guān)。8 記錄：包括