細(xì)胞遺傳室工作手冊(cè)SOP

1、2.2 2.2 培養(yǎng)室第一章 設(shè)備與器械中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)國(guó)家 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室作業(yè)指導(dǎo)書文件編號(hào)版本 /修訂號(hào)1.1 實(shí)驗(yàn)室用房使用規(guī)范發(fā)布日期實(shí)施日期目的規(guī)范實(shí)驗(yàn)室用房，確保實(shí)驗(yàn)室工作和業(yè)務(wù)用房的正常需要，以促進(jìn)科室的發(fā)展，確保各項(xiàng)工作順利進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)室用房規(guī)范與要求細(xì)胞遺傳學(xué)實(shí)驗(yàn)室一般分為洗滌室、培養(yǎng)室、 細(xì)胞學(xué)處理室、閱片室、 暗室、檔案室。其要求一般與其他普通實(shí)驗(yàn)室的要求基本相同:便于所有器具的清洗。便于準(zhǔn)備消毒及各種試劑的保藏。便于使用各種方法檢測(cè)待檢標(biāo)本，進(jìn)行細(xì)胞遺傳學(xué)方面的臨床診斷。但同時(shí)需要具有暗室并具有符合醫(yī)療檔案存放的檔案室。洗滌室玻璃器皿的清洗、包裝， 培養(yǎng)物質(zhì)的準(zhǔn)

2、備與消毒，供應(yīng)物品的保藏等工作都需在洗滌室里進(jìn)行，洗滌室的大小一般為4m 6m，洗滌室應(yīng)設(shè)有下列設(shè)備：一個(gè)清洗玻璃器皿的水槽，便于清洗、晾干；電熱干燥消毒箱，用于玻璃器皿的干熱滅菌；高壓蒸汽滅菌鍋，用于不能耐受干熱滅菌物品的處理；烤箱兩個(gè)便于烤干玻璃器皿或高壓蒸汽滅菌物品；石英玻璃雙重蒸餾器或超純水裝置，用于蒸餾水或超純水的制備；真空泵一個(gè)，以備配制培養(yǎng)基過(guò)濾時(shí)用；物品準(zhǔn)備臺(tái)，以備包裹玻璃器皿等；儲(chǔ)柜或儲(chǔ)架，便于清洗干燥的器皿或其它物品存放；酸缸， 一般最好是耐酸材料，用于盛裝清洗液，清洗液多為含重鉻酸鉀的硫酸溶液。培養(yǎng)室包括操作間和緩沖室，操作室功能是進(jìn)行無(wú)菌操作和細(xì)胞培養(yǎng)，如各種組織取材與

3、接種材料的準(zhǔn)備、培養(yǎng)物的生長(zhǎng)狀態(tài)觀察等，因此應(yīng)配有超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、倒置顯微鏡、小型低速離心機(jī)、冰箱、玻璃柜等。緩沖室則是供工作人員進(jìn)入培養(yǎng)室前換消毒衣服、鞋、帽等之用。培養(yǎng)室一般3m 3m 已夠用，要求清潔、干燥、不通風(fēng)、光線適宜。操作間必須墻壁光滑并裝有空調(diào)器，操作間與外間實(shí)驗(yàn)室之間最好有傳遞窗，以便傳遞臨時(shí)需用的實(shí)驗(yàn)用品。培養(yǎng)室空氣消毒可采取紫外線消毒或空氣凈化。細(xì)胞學(xué)處理室細(xì)胞學(xué)處理室需要配備普通離心機(jī)、恒溫水浴箱及恒溫電烤箱（烤片用）等，主要用于染色體的收獲與顯帶。暗室暗室用于對(duì)熒光原位雜交技術(shù)結(jié)果的觀察和分析，配備熒光顯微鏡和分析系統(tǒng)。中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)國(guó)家 重

4、點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室作業(yè)指導(dǎo)書文件編號(hào)版本 /修訂號(hào)1.2 各類儀器設(shè)備標(biāo)準(zhǔn)操作規(guī)程發(fā)布日期實(shí)施日期目的規(guī)范各類儀器的正常使用和保養(yǎng)，延長(zhǎng)儀器的使用壽命，確保各結(jié)果的準(zhǔn)確性。儀器使用環(huán)境：1）無(wú)灰塵、通風(fēng)環(huán)境良好。2）避免陽(yáng)光直射。3）室內(nèi)溫度18 30，變化不超過(guò)24）室內(nèi)濕度2 80%RH。5）電源電壓變化再20V 10V 之內(nèi)， 5m 內(nèi)不能有配電器。使用儀器程序超凈工作臺(tái)超凈工作臺(tái)是目前實(shí)驗(yàn)室內(nèi)普遍應(yīng)用的無(wú)菌操作裝置，在超凈工作臺(tái)內(nèi)進(jìn)行無(wú)菌操作，可明顯地減少細(xì)菌污染的機(jī)會(huì)。超凈工作臺(tái)的工作原理是利用鼓風(fēng)機(jī)驅(qū)動(dòng)空氣，通過(guò)高效空氣微粒濾層凈化，使操作范圍形成無(wú)菌環(huán)境。CO2培養(yǎng)箱實(shí)驗(yàn)室一般應(yīng)置備二臺(tái)C

5、O2培養(yǎng)箱，將來(lái)自同一標(biāo)本的培養(yǎng)瓶分兩線放入不同的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，以保證細(xì)胞培養(yǎng)的成功率。CO2培養(yǎng)箱常見的是隔水式培養(yǎng)箱。 培養(yǎng)的細(xì)胞需要一個(gè)恒定的溫度，過(guò)低或過(guò)高的環(huán)境溫度均可導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此對(duì)培養(yǎng)箱的靈敏度要求在0.5 。此外，一定濃度的CO2也是細(xì)胞培養(yǎng)所必需的。CO2培養(yǎng)箱可恒定地提供細(xì)胞所需的CO2（通常是5%） , 使培養(yǎng)液的pH值保持穩(wěn)定，適用于開放性培養(yǎng)。使用時(shí)應(yīng)注意每三個(gè)月定期校正，如有異常應(yīng)及時(shí)調(diào)整。培養(yǎng)箱內(nèi)空氣必須保持清潔，應(yīng)定期用酒精擦拭消毒，消毒時(shí)每層隔板均需洗刷干凈，并用75酒精紗布擦拭。每周定期更換箱底水盤中的水，以保持相對(duì)濕度。為防污染可在水盤內(nèi)加入1新潔爾滅

6、。箱內(nèi)高效空氣過(guò)濾器堵塞時(shí)，指示燈提示后需及時(shí)更換烤箱烤箱用于玻璃器皿的烘干和干熱滅菌，一般以650mm 500mm 500mm的比較適用。 烤箱都裝有鼓風(fēng)裝置，鼓風(fēng)與升溫同時(shí)開始。干熱滅菌物品時(shí)一般為180維持 1.5h ，滅菌后應(yīng)待箱內(nèi)溫度下降至80時(shí)方可開門，以免驟冷而致玻璃器皿損壞。應(yīng)注意的是橡皮制品、塑料培養(yǎng)板、有機(jī)玻璃制品禁用烤箱滅菌。恒溫水浴鍋恒溫水浴鍋是實(shí)驗(yàn)室不可缺少的設(shè)備。主要用于顯帶處理和培養(yǎng)基的加溫。由專人負(fù)責(zé)每周更換蒸餾水并添加防腐劑。水純化裝置離體培養(yǎng)的細(xì)胞對(duì)水的要求特別高，培養(yǎng)細(xì)胞用的器皿清洗最后一道程序應(yīng)用二蒸水沖洗，培養(yǎng)基的配制也應(yīng)用二蒸水或超純水。目前常用的有

7、自動(dòng)雙重純水蒸餾器（石英管加熱），因?yàn)槠胀ǖ南鹌?duì)細(xì)胞是有毒的，所以制備好的二蒸水應(yīng)避免通過(guò)橡皮管放出。冰箱實(shí)驗(yàn)室必須配備有普通冰箱和低溫冰箱（ -20 ）， 普通冰箱用于培養(yǎng)液、生理鹽水、Hanks溶液等試劑和標(biāo)本短期的存放，低溫冰箱用于貯存需要冷凍保持生物活性及長(zhǎng)時(shí)間存放的試劑如血清等。細(xì)胞冷凍貯存器細(xì)胞冷凍裝置一般分為運(yùn)輸用和儲(chǔ)存用二種液氮罐，用于細(xì)胞株和標(biāo)本的保存， 液氮罐雙層結(jié)構(gòu)中間為真空層，其內(nèi)膽頸部與體部經(jīng)焊接相連，故搬動(dòng)和裝入液氮時(shí)，應(yīng)緩慢加入，使容器內(nèi)的溫度均勻下降，有條件可配備有程控降溫儀的液氮儲(chǔ)存系統(tǒng)，該系統(tǒng)的特點(diǎn)是可自動(dòng)控制冷凍箱的降溫速度。離心機(jī)細(xì)胞培養(yǎng)需要經(jīng)常消化分

8、離細(xì)胞、漂洗制備細(xì)胞懸液和進(jìn)行傳代以及染色體的收獲， 因此接種培養(yǎng)室與細(xì)胞處理室內(nèi)可各配置一臺(tái)可調(diào)速的小型臺(tái)式離心機(jī)。高壓蒸汽滅菌裝置高壓滅菌是利用高壓蒸汽使細(xì)菌體內(nèi)蛋白凝固而達(dá)到滅菌，是最常用的滅菌方法。 在115.5 ，30 分鐘就能殺死所有繁殖型細(xì)菌的芽胞。高壓蒸汽滅菌比其它滅菌方法效果都好。由于蛋白質(zhì)的凝固需有水分存在，當(dāng)細(xì)菌體內(nèi)含有水分在25以下時(shí)，蛋白質(zhì)的凝固溫度如下：水分含量凝固溫度 TOC o 1-5 h z 25 74-808 80-906 145由此可見，在細(xì)菌體內(nèi)有水分存在的條件下可以大大降低滅菌所需的溫度。高壓滅菌主要用于細(xì)胞培養(yǎng)所需的二蒸水、生理鹽水、手術(shù)器械、布類、

9、橡皮類等。顯微鏡與細(xì)胞遺傳圖象分析工作站顯微鏡是分析染色體的必備工具，一般要求每位實(shí)驗(yàn)室技術(shù)人員配備一臺(tái)。有條件的實(shí)驗(yàn)室可配備細(xì)胞遺傳圖象分析工作站。維護(hù)保養(yǎng)記錄每日保養(yǎng)每日登記各儀器的運(yùn)行和使用情況，保證每臺(tái)儀器的正常運(yùn)行。每周保養(yǎng)每周對(duì)各儀器進(jìn)行清潔維護(hù)，檢查各儀器是否存在各類使用的隱患。每月保養(yǎng)每月不定期的對(duì)各儀器進(jìn)行抽樣檢查運(yùn)行使用情況的檢查。小型設(shè)備天平 普通稱量0.1 克的電子天平以及分析天平是實(shí)驗(yàn)室所必需的，要求每年做一次校正。真空泵 培養(yǎng)液的配制都用過(guò)濾的方法進(jìn)行除菌，一般 30升旋轉(zhuǎn)式的真空泵即可。酸度計(jì) 又稱為氫離子測(cè)定計(jì)或pH計(jì)，是測(cè)定各種液體酸堿度的必須工具，要求每半年

10、做一次校正。加樣器加樣器是細(xì)胞培養(yǎng)不可缺少的用具，其規(guī)格有0.5-10ul 、 10-100ul 、100-1000ul, 末端可安裝不同容量吸管，吸入和注入液體較方便。使用時(shí)吸入的液體量不能在其設(shè)定范圍之外，而且要求每半年做一次校正。常用玻璃器皿及器械培養(yǎng)器皿是供細(xì)胞接種生長(zhǎng)等用的器皿，可用透明度好，中性硬質(zhì)的玻璃制成。另外，還可使用透明、平滑、無(wú)毒、干凈并經(jīng)放射性核素照射滅菌密封包裝的一次性使用塑料培養(yǎng)器皿，其優(yōu)點(diǎn)是打開包裝即可用于培養(yǎng)操作，缺點(diǎn)是費(fèi)用較高。目前國(guó)內(nèi)一般實(shí)驗(yàn)室使用的還是玻璃器皿。溶液瓶其規(guī)格常為500ml、 250ml、 100ml 的配膠塞的鹽水瓶和配塑料螺旋蓋的盛液瓶，

11、用于貯存各種試劑等。培養(yǎng)瓶有玻璃和塑料二種，常用的規(guī)格有25cm2（70ml） 和 75cm（ 2 275ml） ，160-175 cm2（ 600ml）等規(guī)格，國(guó)內(nèi)培養(yǎng)瓶常用的規(guī)格有25ml， 100ml 和 250ml等規(guī)格， 主要用于細(xì)胞培養(yǎng)，早期的玻璃培養(yǎng)瓶是用膠塞封口，僅能用于密閉培養(yǎng)，現(xiàn)被螺旋蓋培養(yǎng)瓶取代。螺旋蓋培養(yǎng)瓶適宜在CO2培養(yǎng)箱中使用，瓶的底壁是供細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)的生長(zhǎng)面，而其它內(nèi)壁為非生長(zhǎng)面。培養(yǎng)皿 有玻璃和塑料二種，常用的有120mm， 100mm和 60mm等規(guī)格，主要用于培養(yǎng)和分離組織用，也可用作單細(xì)胞分離及單層細(xì)胞貼壁培養(yǎng)等實(shí)驗(yàn)，。多孔培養(yǎng)板材料僅有塑料的一種，其規(guī)格

12、有96 孔， 24孔， 12孔， 6孔，4 孔，用于少量細(xì)胞或單個(gè)細(xì)胞的克隆生長(zhǎng)，細(xì)胞轉(zhuǎn)化及細(xì)胞毒性等各種檢測(cè)實(shí)驗(yàn)。吸管 有玻璃和塑料二種，主要用于移送培養(yǎng)基，玻璃吸管有直頭和彎頭二種，直頭吸管用于吸加少量培養(yǎng)基，加抗菌素，加NaHC3O、調(diào)pH等用；彎頭吸管用于吹打分散和混懸細(xì)胞用。離心管 有玻璃和塑料二種，主要用于離心、漂洗和分離細(xì)胞，常用的規(guī)格有50ml， 10ml ， 5ml 三種規(guī)格，此外還有微量離心管，規(guī)格有1.5ml ， 1ml，0.5ml ，以供貯存少量試劑或其它實(shí)驗(yàn)用。器械主要用于取材和原代培養(yǎng)中切割組織。常用的器械有：組織剪、鑷子等。使用過(guò)程中應(yīng)注意保護(hù)刀鋒，用畢擦凈、晾干

13、、以防生銹，消毒以煮、高壓滅菌或75%酒精浸泡。其它如配制溶液的量筒、容量瓶以及試管、高壓消毒用貯槽、鋁飯盒、各種膠塞、凍存管、鋁制吸管筒、各種試管架、研缽、各種橡皮塞、洗耳球、滴頭、燒杯、玻棒、各種大小規(guī)格不同的試劑瓶、載玻片、蓋玻片、針頭式塑料抽濾器、0.45um醋酸纖維膜、酸缸、各種泡酸用的耐酸尼龍網(wǎng)袋、銅絲筐、耐酸手套、試劑瓶沖洗器、記號(hào)筆、染色缸、染色架、玻片板、酒精燈。第二章 培養(yǎng)用品的清洗及準(zhǔn)備中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)國(guó)家 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室作業(yè)指導(dǎo)書文件編號(hào)版本/修訂號(hào)培養(yǎng)用品的清洗及準(zhǔn)備發(fā)布日期實(shí)施日期1 洗滌液的配制重鉻酸鉀清潔液的配制配制方法按比例稱取置于特制的耐酸酸缸內(nèi)（

14、50 克重鉻酸鉀加1000ml 水） ，加熱使其溶解，冷卻后再慢慢加入工業(yè)粗硫酸（90ml 粗硫酸） ，注意切不可將水加入硫酸中，邊加邊攪拌。配好的清潔液為深褐色。清潔液的配制，可分為強(qiáng)酸溶液與弱酸溶液（見表1.1 ）可視需要而選用表 1.1 清潔液的配方成分強(qiáng)酸溶液弱酸溶液重鉻酸鉀（g）120g50g濃硫酸（ml）160ml90ml蒸餾水（ml）1000ml1000ml配制清潔液的注意事項(xiàng)：1戴防護(hù)面罩、手套、圍裙等。2如不慎將清潔液灑出，應(yīng)用沙土吸附，用塑料簸箕收起，然后用水沖洗。3配制時(shí)切記千萬(wàn)不要以水加入硫酸，以防大量產(chǎn)熱使容器爆裂而造成事故。4一定待清潔液冷卻后再放入容器中，以免熱脹

15、冷縮而使容器破裂，造成事故。使用硫酸清潔液的注意事項(xiàng)：硫酸為強(qiáng)吸水性物質(zhì)，故泡酸的器皿一定要晾干，不要帶水太多，這樣可延長(zhǎng)使用時(shí)間。用堿處理過(guò)的器皿必須沖洗干凈才可放入清洗細(xì)胞培養(yǎng)專用的酸缸。硫酸比重大，應(yīng)注意安全，不可單手握裝滿洗滌液的量筒等，以防掉在地上打破容器。如不小心將硫酸濺到眼里，要盡快用水沖，并用眼杯裝3 NaHC3O溶液清洗。當(dāng)清潔液的顏色發(fā)綠或混濁時(shí)，說(shuō)明使用過(guò)久，效力降低，應(yīng)重新配制。玻璃器皿的清洗細(xì)胞培養(yǎng)中，玻璃器皿的清洗是個(gè)十分重要的環(huán)節(jié)，清洗后的玻璃器皿不僅要求干凈透明，無(wú)油跡， 且不能殘留任何有毒物質(zhì)，一般玻璃器皿的清洗包括刷洗、浸酸和沖洗三個(gè)步驟。刷洗將待清洗的玻璃

16、器皿在洗滌液中煮沸30 分鐘后進(jìn)行刷洗，刷洗時(shí)應(yīng)注意二點(diǎn)，一是要選用軟毛毛刷，刷洗時(shí)用力要輕，使用多次的毛刷要更換，防止損傷器皿表面或造成劃痕；二是刷洗時(shí)不能留下死角，刷洗后，用自來(lái)水徹底沖洗，稍晾干，浸酸。浸酸浸酸是將刷洗和晾干后的玻璃器皿浸泡到由重鉻酸鉀、濃硫酸和蒸餾水配制的清潔液中，利用強(qiáng)氧化作用清除瓶皿表面可能殘留的有機(jī)物，浸泡時(shí)一定要使器皿完全浸入清潔液中，器皿中不能有氣泡，浸泡時(shí)間4 小時(shí)以上。沖洗浸酸后的器皿必須用自來(lái)水沖洗干凈，沖 8-10 次后再用一蒸水沖二次，二蒸水沖一次，整個(gè)沖洗過(guò)程應(yīng)連續(xù)進(jìn)行。膠塞和塑料用品的清洗膠塞新購(gòu)置的膠塞有大量滑石粉應(yīng)先用自來(lái)水沖洗干凈后，再作常

17、規(guī)處理。常規(guī)清洗方法是每次用完的膠塞要置入水中浸泡，然后用洗潔精或2%NaO煮沸H10分鐘，自來(lái)水沖洗晾干后，再用1%稀鹽酸浸泡30 分鐘到 4 小時(shí)，用自來(lái)水沖洗干凈，最后分別用一蒸水和二蒸水各煮沸兩次，二蒸水沖洗，晾干備用。塑料用品塑料用品使用后也要用水浸洗，嚴(yán)防附著物干結(jié)，如殘留有附著物，要即時(shí)用紗布拭掉，用流水沖洗干凈后在2%N aOH溶液中浸泡過(guò)夜，自來(lái)水沖液，再用1%稀鹽酸浸泡30 分鐘，用自來(lái)水沖洗干凈，最后分別用一蒸水和二蒸水沖洗，晾干備用。清洗后物品的包裝目的清洗烘干后的培養(yǎng)物品應(yīng)即時(shí)包裝，以備消毒滅菌。物品準(zhǔn)備 ：包裝常用牛皮紙、鋁盒，貯槽、專用金屬消毒筒等。方法：對(duì)于較大

18、的培養(yǎng)用品如溶液瓶、濾器等可用雙層牛皮紙將瓶口緊密包起來(lái)，包好后用線繩扎緊，進(jìn)行局部包裝。對(duì)于小型的培養(yǎng)用品，如培養(yǎng)瓶、圓瓶、離心管、試管、吸管、培養(yǎng)皿、膠塞等可先裝入鋁盒，貯槽或?qū)Ｓ媒饘傧就病Ｅ囵B(yǎng)用品的消毒和滅菌目的防止污染、保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。方法物理滅菌法，包括紫外線、干熱、濕熱（高壓蒸汽），過(guò)濾等手段。2、化學(xué)滅菌法主要指使用化學(xué)消毒劑滅菌。原理及用途1、紫外線是一種低能量的電磁輻射，可以殺死多種微生物。2、干熱滅菌法主要用于玻璃器皿的消毒，溫度180維持90 分鐘，才能殺死細(xì)菌芽孢，達(dá)到滅菌目的。3、干熱滅菌法主要用于玻璃器皿的消毒，溫度180維持90 分鐘，才能殺死細(xì)菌芽孢，達(dá)

19、到滅菌目的。4、濕熱滅菌法即高壓蒸汽滅菌，用于布類、膠塞、金屬器械、濾器、玻璃器皿以及培養(yǎng)用液的滅菌。5、過(guò)濾除菌是將液體用具有微孔的薄膜過(guò)濾，大多數(shù)培養(yǎng)用液如人工合成培養(yǎng)基、血清、酶溶液等，由于在高溫下會(huì)發(fā)生變化，而失效，所以必須采取過(guò)濾除菌，常用的濾器有各種不同孔徑的玻璃砂芯濾器。6、化學(xué)滅菌法主要指化學(xué)消毒劑?；瘜W(xué)消毒法是利用化學(xué)消毒劑消毒那些不能用物理消毒等方法進(jìn)行消毒的物品和場(chǎng)地，如接種培養(yǎng)室的空間，操作臺(tái)面以及操作者的皮膚。具體標(biāo)準(zhǔn)及要求細(xì)胞培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)最危險(xiǎn)的是發(fā)生包括細(xì)菌、真菌和病毒等微生物的污染，它們都能直接影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，污染主要產(chǎn)生在操作者的疏忽，如培養(yǎng)室未定期消毒，操作臺(tái)表面

20、或周圍空氣不潔，培養(yǎng)器具消毒滅菌不徹底，或者放的用具時(shí)間過(guò)長(zhǎng)等因素，因此細(xì)胞培養(yǎng)的每一個(gè)環(huán)節(jié)都要高度謹(jǐn)慎，認(rèn)真。紫外線是一種低能量的電磁輻射，可以殺死多種微生物，主要用于培養(yǎng)室內(nèi)空氣、操作臺(tái)面及地面的消毒，掛在離地10 尺的高度，使得各地最少每平方尺有 30 微瓦特的照射，才能發(fā)揮有效作用。干熱滅菌法主要用于玻璃器皿的消毒，溫度180維持90 分鐘，才能殺死細(xì)菌芽孢，達(dá)到滅菌目的。濕熱滅菌法即高壓蒸汽滅菌，用于布類、膠塞、 金屬器械、濾器、 玻璃器皿以及培養(yǎng)用液的滅菌，實(shí)驗(yàn)室一般使用需求配備1-2 臺(tái)高壓蒸汽滅菌器。培養(yǎng)用液、橡膠制品、濾器一般 10 磅 15 分鐘，布類、玻璃制品、金屬器械等

21、一般15磅 20分鐘。過(guò)濾除菌是將液體用具有微孔的薄膜過(guò)濾，大多數(shù)培養(yǎng)用液如人工合成培養(yǎng)基、血清、 酶溶液等，由于在高溫下會(huì)發(fā)生變化，而失效，所以必須采取過(guò)濾除菌，常用的濾器有各種不同孔徑的玻璃砂芯濾器。另外還有一次性濾器，品種極多，使用方便，我室目前主要使用一次性濾器。化學(xué)滅菌法主要指化學(xué)消毒劑。化學(xué)消毒法是利用化學(xué)消毒劑消毒那些不能用物理消毒等方法進(jìn)行消毒的物品和場(chǎng)地，如接種培養(yǎng)室的空間，操作臺(tái)面以及操作者的皮膚。化學(xué)制劑包括新潔爾滅、過(guò)氧乙酸和酒精等，乳酸可用于接種培養(yǎng)室內(nèi)和周圍環(huán)境的定期空氣消毒，過(guò)氧乙酸消毒能力極強(qiáng)，在0.5%濃度 10分鐘可將芽孢殺滅，可用作各種物品的表面消毒。1的

22、新潔爾滅是細(xì)胞培養(yǎng)室常用的，可用于操作者的皮膚消毒，器械的浸泡，物品的清洗，操作臺(tái)面的擦拭等第三章 常用實(shí)驗(yàn)溶液試劑的配制中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)國(guó)家 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室作業(yè)指導(dǎo)書文件編號(hào)版本/修訂號(hào)常用實(shí)驗(yàn)溶液試劑的配置發(fā)布日期 實(shí)施日期1 目的規(guī)范試劑的配制，為臨床實(shí)驗(yàn)的可靠性提供質(zhì)量保障。原則專人負(fù)責(zé)，一劑一皿，一配一錄，雙人核簽。定期校對(duì)，可溯源。性能特征規(guī)范試劑的配制，為臨床提供準(zhǔn)確穩(wěn)定有效的試劑，減少人為因素對(duì)臨床試驗(yàn)結(jié)果的影響。方法化學(xué)實(shí)驗(yàn)試劑的配制方法試劑與耗材量筒、燒杯、玻棒、電子稱、量杯、容量瓶、定容瓶、油紙、藥勺、100ul加樣槍、100ul 槍頭操作步驟生理鹽水準(zhǔn)確稱取氯

23、化鈉（NaCl） （生產(chǎn)商xxxx, 批號(hào) xxxx 有效期 xxx）8.5 g，加二蒸水溶解定容至1L，待充分溶解混勻裝瓶，貼標(biāo)簽（配置日期、藥品名稱、濃度、用途、有效期、配制雙人），記錄雙人簽名0.075M 氯化鉀溶液氯化鉀（ KCl） 5.587g ，加二蒸水至1000ml，室溫保存，用于細(xì)胞低滲處理。12 SSC溶液氯化鈉（NaCl） 105.3g檸檬酸鈉（Na3C6H3O7 5H2O）52.94g加二蒸水至1000ml，室溫保存，臨用時(shí)用二蒸水稀釋至所需濃度。0.25%胰蛋白酶溶液（Trypsin）胰蛋白酶粉末（1:250） 250mg無(wú) Ca2+, Mg2+的 PBS加至 100m

24、l先用少許消毒的PBS 將胰蛋白酶粉末溶解，再補(bǔ)足PBS 至 100ml，攪拌混勻，置4冰箱4小時(shí)，用0.22um微孔濾膜除菌，分裝成小瓶于-20保存，用于消化細(xì)胞。Giemsa染色液Giemsa儲(chǔ)備液：配制： Giemsa粉末 1g加少許甘油混合研碎共計(jì)加入甘油66ml， 充分混勻倒入燒杯中在55-60水浴中加熱2 小時(shí) 冷卻 加入甲醇66ml，充分混合 在室溫中靜置2-3 周，過(guò)濾貯存于棕色瓶中，可長(zhǎng)期使用。6%Giemsa工作液：47ml 蒸餾水中加入Giemsa儲(chǔ)備液 3ml，用于染色體標(biāo)本的染色，一般染色時(shí)間為10-20 分鐘。無(wú)鈣鎂離子溶液氯化鈉（NaCl）8 g氯化鉀（KCl ）

25、0.2g檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7?2H2O） 1g磷酸二氫鈉（NaH2PO4?H2O） 0.05g碳酸氫鈉（NaHCO3） 1g葡萄糖 1g依次溶于二蒸水，最后加二蒸水至1000ml， 用除菌濾器除菌，保存于4冰箱備用。Hanks 溶液（ 1）原液甲： TOC o 1-5 h z 氯化鈉（NaCl）80g氯化鉀（KCl ）4g硫酸鎂（MgSO4?7H2O）1g氯化鎂（MgCl2?6H2O）1g氯化鈣（CaCl2）0.714g將氯化鈣溶液于50ml 二蒸水中，其它依次溶于100ml 二蒸水中，兩液混合，加二蒸水至500ml，加氯仿保存于4冰箱中。（ 2）原液乙： TOC o 1-5 h z

26、 磷酸氫二鈉（Na2HPO4）1.52g磷酸氫二鉀（KH 2PO4）0.6g葡萄糖10g0.4%酚紅液50ml依次溶于400ml 二蒸水中，加入酚紅液，加二蒸水至500ml，加入氯仿，保存于4冰箱中。（ 3）使用液：取原液甲25ml，原液乙25ml，加入已預(yù)先滅菌的二蒸水至500ml，分別裝入溶液瓶中，以9 磅高壓蒸汽滅菌10 分鐘，冷卻后，置4冰箱中保存，使用前以3.5%的 NaHCO3液調(diào)pH。0.02%乙二胺四乙酸二鈉溶液 TOC o 1-5 h z 乙二胺四乙酸二鈉（EDTA）0.1g氯化鈉（NaCl）4g氯化鉀（KCl ）0.1g磷酸氫二鈉（Na2HPO4?H2O）0.576g磷酸二

27、氫鉀（KH2PO4）0.1g葡萄糖0.1g依次溶于二蒸水中，加入0.4%酚紅溶液2.5ml，最后加入二蒸水至500ml，用溶液瓶分裝，9 磅 10 分鐘高壓蒸汽滅菌，保存于4冰箱，使用時(shí)用3.5%碳酸氫鈉溶液調(diào)pH，用于分散細(xì)胞。秋水仙素溶液稱取 2 毫克秋水仙素，溶解于100 ml 0.85%的 NaCl 溶液中，用時(shí)最終濃度根據(jù)不同的培養(yǎng)材料而定，一般0.04-0.08 g /m培養(yǎng)液。l抗菌素和抗霉素溶液為了預(yù)防因無(wú)菌操作不嚴(yán)而發(fā)生污染，通常在培養(yǎng)液內(nèi)加入適量的抗菌素，常用的有青霉素和鏈霉素合用，濃度分別為50-100IU/1ml，還有放線菌素B（ Actinomycin B ）或制霉菌

28、素（mycostatin）可抑制霉菌污染。組織、細(xì)胞培養(yǎng)常用抗生素見表3-5表 3-5 組織、細(xì)胞培養(yǎng)常用抗生素液（引自Pollard et al. 1997）抗生素作用對(duì)象參考濃度（g/ml）穩(wěn)定性（d）二性霉素-B真菌13氨芐青霉素革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌1003氯霉素革蘭氏陰性菌55紅霉素革蘭氏陽(yáng)性、支原體1003慶大霉素革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌、 支原體505卡那霉素革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌1005制霉菌素真菌503青霉素-G革蘭氏陽(yáng)性菌100IU/ml3鏈霉素革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌1003利福平革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌503四環(huán)素革蘭氏陽(yáng)性、陰性菌、 支原體104* 使用表中所列出的工作濃度，可在37長(zhǎng)時(shí)間控制

29、輕度污染，而對(duì)細(xì)胞無(wú)毒性作用。 大多數(shù)的體外培養(yǎng)都使用青霉素和鏈霉素，其它抗生素僅在特殊情況下使用。6.11 小牛血清小牛的年齡約6 個(gè)月，體重限于500 磅以內(nèi)，放血致死，取得小牛血清。肝素溶液取肝素 1g 加無(wú)菌生理鹽水2.5ml，即成4%的肝素溶液，可用于肝素化外周血培養(yǎng)基。而抽血時(shí)則用臨床注射用肝素（每支2ml 含肝素 12500U）外周血細(xì)胞培養(yǎng)液25毫升培養(yǎng)瓶中加入RPMI-1640 培養(yǎng)基 4ml，小牛血清1ml， PHA 適量，0.4%肝素0.05ml，雙抗：青霉素和鏈霉素，終濃度為100U/ml，用3.5%碳酸氫 TOC o 1-5 h z 鈉調(diào)節(jié) pH 為 7.2-7.4（

30、目前實(shí)驗(yàn)室已采用商業(yè)化培養(yǎng)基）。骨髓及其他懸浮細(xì)胞培養(yǎng)液含有20%小牛血清的RPMI1640 培養(yǎng)基（或其他人工綜合培養(yǎng)基），培養(yǎng)基的用量可視骨髓細(xì)胞的多少而定，一般為5 ml。rdu 和 Frdu 溶液Brdu 250 g/ml稱取Brdu 62.5mg加生理鹽水定容至250mlFrdu 2.6mM稱取Frdu128.024mg，二蒸水溶解定容至200ml，過(guò)濾除菌，避光保存。6.1650% AgNO3稱取AgNO3 5g ， HCOOH 10ul, 加去離子水至10ml卡諾固定液（甲醇:乙酸=3:1）5% Ba（OH） 2稱取 Ba（OH）2 2.5g加二蒸水50ml 溶解7 高分辨染色體

31、制備試劑的配制Frdu 母液：準(zhǔn)確稱取5-氟脲嘧啶核苷（Frdu）粉末0.0248g，加去離子水溶解，定容至 10ml， 即配成10-2M 的 Frdu 母液。 過(guò)濾分裝成1ml/管，-20中凍存待用。Frdu 工作液：準(zhǔn)確量取已配制好的10-2MFrdu 母液稀釋1000倍，即配成濃度為10-5M的 Frdu 工作液。過(guò)濾分裝，4中冷藏待用。Uridine 母液 :準(zhǔn)確稱取脲嘧啶核苷（Uridine） 粉末 0.0246g, 加去離子水溶解，定容至10ml， 即配成10-2M 的 Uridine 母液。 過(guò)濾分裝成1ml/管，-20中凍存待用。Uridine 工作液 :準(zhǔn)確量取已配制好的10

32、-2MUridine 母液加去離子水稀釋100倍， 即配成濃度為10-4M 的 Uridine 工作液。過(guò)濾分裝，4中冷藏待用。TDR 母液 :準(zhǔn)確稱取胸腺嘧啶核苷（TDR）粉末0.2432g, 加去離子水溶解，定容至10ml，即配成10-1M TDR 母液。 過(guò)濾分裝成1ml/管，-20中凍存待用。TDR 工作液 :準(zhǔn)確量取已配制好的10-1M TDR 母液稀釋100 倍， 即配成濃度為10-3M 的TDR 工作液。過(guò)濾分裝，4中冷藏待用。EB 工作液 :準(zhǔn)確稱取溴乙啶（EB）粉末0.05g, 加去離子水溶解，定容至50ml, 即配成濃度為1mg/ml 的 EB 溶液。過(guò)濾分裝，4 中冷藏待

33、用。秋水仙胺工作液:準(zhǔn)確稱取秋水仙胺粉末0.01g， NaCl4.5g, 加去離子水溶解，定容至500ml, 即配成濃度為20 g/ml 的秋水仙胺溶液。過(guò)濾分裝，4中冷藏待用。第四章 人體細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)國(guó)家 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室作業(yè)指導(dǎo)書文件編號(hào)版本 /修訂號(hào)4.1 人淋巴細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備發(fā)布日期實(shí)施日期目的規(guī)范外周血標(biāo)本細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備過(guò)程，為臨床外周血淋巴細(xì)胞染色體核型分析可靠性提供質(zhì)量保證。測(cè)試方法密閉式培養(yǎng)/手工收獲測(cè)試原理外周血中的淋巴細(xì)胞幾乎都是處在G0期或G1期，一般情況下是不分裂的。當(dāng)在培養(yǎng)基中加入植物血凝素(phytohemagglutin

34、in PHA )時(shí)，這種小淋巴細(xì)胞受到刺激后轉(zhuǎn)化為淋巴母細(xì)胞，并開始進(jìn)行有絲分裂。經(jīng)過(guò)短期培養(yǎng)后，用秋水仙素處理就可獲得大量中期分裂相的細(xì)胞，制片后可以清楚地對(duì)染色體進(jìn)行觀察與分析。性能特征經(jīng) G顯帶處理后可見300-550 條顯帶。. 樣本特征及受檢者準(zhǔn)備外周血用5ml 滅菌注射器吸取注射用肝素(6250U/ml) 0.05 ml 濕潤(rùn)管壁。消毒皮膚，于肘靜脈采血約5ml，立即送檢。試劑人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基(必須具備三證)， 秋水仙素：濃度20 g/ml 低滲液： 0.075mol/L 的 KCl 溶液，卡諾固定液試劑與耗材超凈工作臺(tái)、待檢標(biāo)本、酒精燈， 燒杯， 天平， 離心機(jī)， 恒溫培

35、養(yǎng)箱，冰盒，載玻片，玻片盒，光學(xué)顯微鏡，滅菌注射器(5ml) ，離心管，無(wú)菌吸管，量筒，培養(yǎng)瓶，試劑瓶等。操作程序淋巴細(xì)胞培養(yǎng)與處理取血：外周血用5ml 滅菌注射器吸取注射用肝素（6250U/ml） 0.05 ml 濕潤(rùn)管壁。消毒皮膚，于肘靜脈采血約5ml。在酒精燈火焰旁，向培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)人體外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)基中接種，外周血每瓶0.3-0.5ml （用 5ml 的注射器的7 號(hào)黑色針頭垂直滴加；男：G帶：1 線28滴，2線 30滴；女性多種2 滴） 。接種后輕輕水平搖動(dòng)幾次混勻。細(xì)胞培養(yǎng)：直立于培養(yǎng)箱內(nèi)密閉式培養(yǎng)箱培養(yǎng)66-72 小時(shí)。 外周血淋巴細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境的溫度為37oC 0.5 oC， 且一

36、定要以溫箱內(nèi)部溫度為準(zhǔn)，每隔 24小時(shí)左右輕搖1 次，以促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖；秋水仙素處理：培養(yǎng)終止前在培養(yǎng)基中加入濃度為20 g/ml 的秋水仙素0.01-0.02ml （用 1ml 注射器針頭垂直滴加23滴） ，使最終濃度為0.04-0.08 g/ml ， 37oC 0.5 oC培養(yǎng)箱中處理4小時(shí)；低滲處理：秋水仙素處理完畢后，小心地從溫箱取出培養(yǎng)瓶，用吸管吸取培養(yǎng)物入離心管，離心（1500rpm,10min） 。然后加入37oC溫育的 0.075mol/L的 KCl 低滲溶液8ml，用吸管吹打成細(xì)胞懸液，置37oC水浴處理35min；預(yù)固定： 在每個(gè)離心管中加入1.5ml 的固定液，繼續(xù) 3

37、7oC水浴， 5-10min；離心：1500rpm 10min，棄上清液；固定：在離心管中加入固定液6-8ml，立即用吸管輕輕吹打，單個(gè)細(xì)胞懸液，在 37oC水浴中固定5-10min 后，離心，1500rpm， 10min，棄上清液；再固定：重復(fù)第6 步；制片：在離心管中滴入新固定液0.2 毫升，用吸管將淋巴細(xì)胞團(tuán)輕輕吹打成細(xì)胞懸液，從冰箱的冷凍室內(nèi)取出冰片，每片滴加懸液1-2 滴，75oC烤3小時(shí)；染色：用0.025%胰酶消化后用Giemsa染液染色（消化時(shí)間和染色時(shí)間因環(huán)境變化有差別，因此每次顯帶染色應(yīng)進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)）， 然后用鑷子夾出玻片，用自來(lái)水輕輕沖洗兩面，室溫干燥或電吹風(fēng)吹干；鏡檢：待

38、玻片干后，在顯微鏡下檢查。先用低倍鏡尋找良好的分裂相，然后用高倍油鏡觀察。參考范圍染色體數(shù)目：46,XN ；染色體結(jié)構(gòu)：無(wú)明顯結(jié)構(gòu)異常10潛在變異來(lái)源不排除細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生突變的可能性，從而導(dǎo)致染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)改變，因此應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行1-2 線平行操作，以發(fā)現(xiàn)因培養(yǎng)過(guò)程導(dǎo)致的結(jié)果異常。2）接種所用器皿要進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌處理。3）秋水仙素處理時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，分裂細(xì)胞多，染色體短?。环粗?，則少而細(xì)長(zhǎng)。都不宜觀察形態(tài)及計(jì)數(shù)。故秋水仙素的濃度及時(shí)間要準(zhǔn)確掌握。4）低滲使紅細(xì)胞膜破裂，淋巴細(xì)胞膨脹，低滲處理濃度及時(shí)間要適當(dāng)。且低滲后混勻細(xì)胞一定要輕，否則引起膜破裂、染色體散失。5）固定液應(yīng)在使用前臨時(shí)配制，要求新

39、鮮，否則將形成脂類，從而影響固定效果11 環(huán)境安全1）試劑中含有防腐劑和穩(wěn)定劑, 請(qǐng)勿直接接觸皮膚、眼睛、黏膜，一旦接觸，立即用大量清水沖洗；受檢標(biāo)本均應(yīng)假定含有傳染性病原菌，其廢棄過(guò)程應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)室生物安全管理程序進(jìn)行處理；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制環(huán)境及實(shí)驗(yàn)儀器/ 設(shè)備的溫度、濕度等相關(guān)條件，以確保實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定。中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)國(guó)家 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室作業(yè)指導(dǎo)書文件編號(hào)版本 /修訂號(hào)4.2 白血病外周血細(xì)胞培養(yǎng)及染色 體制備發(fā)布日期實(shí)施日期目的反映那些病理細(xì)胞的染色體改變，為臨床提供輔助診斷。實(shí)驗(yàn)方法密閉培養(yǎng) / 手工收獲。實(shí)驗(yàn)原理在不受外界抗原的刺激下，通過(guò)短期培養(yǎng)和直接制片法可以觀察到血

40、液病患者外周血中的異常腫瘤細(xì)胞的核型。性能特征經(jīng) G顯帶處理后可見300-550 條顯帶. 樣本類型及受檢者準(zhǔn)備外周血用5ml 滅菌注射器吸取注射用肝素(6250U/ml) 0.05 ml 濕潤(rùn)管壁。消毒皮膚，于肘靜脈采血約5ml，立即送檢。試劑完全培養(yǎng)基：RPMI-1640 培養(yǎng)基4ml，小牛血清1ml，肝素0.05ml ，雙抗：青霉素和鏈霉素，終濃度為100U/ml， 最后用3.5%碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH為 7.2-7.4 ；秋水仙素：濃度 20 g/ml ， 低滲液： 0.075mol/L 的 KCl 溶液， 卡諾固定液，0.25%EDTA-trypsin ： A液：將0.25g 的 tryp

41、sin 溶于100ml的PBS中，B 液：另將0.02g 的 EDTA溶于 100的 PBS中， 0.25% EDTA-trypsin ： A:B=1:1(V/V) ； 10ml溫育液：1ml 0.25% EDTA-trypsin 、 9ml 0.075 mol/LKCl 。試劑與耗材超凈工作臺(tái)、待檢標(biāo)本、酒精燈， 燒杯， 天平， 離心機(jī)， 恒溫培養(yǎng)箱，冰盒，載玻片，玻片盒，光學(xué)顯微鏡，滅菌注射器(5ml) ，離心管，無(wú)菌吸管，量筒，培養(yǎng)瓶，試劑瓶等。實(shí)驗(yàn)步驟短期培養(yǎng)法取血液病患者外周血，1640或 Hanks液離心洗脫2 次，去除脂肪顆粒，根據(jù)白細(xì)胞量的多少來(lái)確定接種細(xì)胞量，無(wú)菌注入裝有5m

42、l 培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，37培養(yǎng)24 或 48 小時(shí)；加入秋水仙素（終濃度為0.04-0.08 g/ml ） ，繼續(xù)培養(yǎng)55 分鐘，收獲；將標(biāo)本移入離心管，1500rpm離心10min， 去上清， 加入 0.075mol/L 的 KCl ，37低滲30min；預(yù)固定：加固定液1.5ml ，輕混勻，水浴5 分鐘。固定：加固定液至7ml，輕混勻，1500rpm， 10min，去上清。再固定：加固定液至7ml ，輕混勻，1500rpm， 10min，去上清。視細(xì)胞量調(diào)整懸液，滴片，烤片3小時(shí)，顯帶。直接制備法取 1-2 毫升血液病患者外周血加入RPMI-1640液或Hanks液 8 毫升混勻離心150

43、0rpm， 10 分鐘洗脫2 次，去除脂肪顆粒。棄上清，加1 毫升 0.25% EDTA-trypsin 與 9毫升 0.075 M KCl 混合液至10毫升吹打混勻；加秋水仙素（使終濃度為0.02g/ml ） ，混勻；放至水浴箱，37低滲30分鐘；加 1.5ml 固定液預(yù)固定，水浴5分鐘，輕混勻；1500rpm，室溫，10分鐘，去上清；加固定液至7 毫升，輕混勻；1500rpm，室溫，10分鐘，去上清；重復(fù)固定一次；視細(xì)胞量調(diào)懸液，滴片，烤片3 小時(shí)，顯帶。潛在變異來(lái)源1）采取標(biāo)本注意抗凝，根據(jù)血象調(diào)整接種密度;2）直接法主要用于急性白血病10環(huán)境和安全控制1）試劑中含有防腐劑和穩(wěn)定劑,請(qǐng)勿

44、直接接觸皮膚、眼睛、黏膜，一旦接觸，立即用大量清水沖洗；2）受檢標(biāo)本均應(yīng)假定含有傳染性病原菌，其廢棄過(guò)程應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)室生物安全管理程序進(jìn)行處理；3)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制環(huán)境及實(shí)驗(yàn)儀器/設(shè)備的溫度、濕度等相關(guān)條件，以確保實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定。中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)國(guó)家 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室作業(yè)指導(dǎo)書文件編號(hào)版本 /修訂號(hào)4.3 外周血淋巴細(xì)胞建株發(fā)布日期實(shí)施日期目的規(guī)范外周血淋巴細(xì)胞建株操作過(guò)程，通過(guò)建立永生化大量增殖的類淋巴母細(xì)胞系，為保存家族性疾病家系成員特有的基因組資源及臨床研究奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。方法EB病毒轉(zhuǎn)化原理環(huán)孢霉素（CYA）是一種能在G0-G1期之間選擇性地抑制T淋巴細(xì)胞RNA聚合酶 II 的免

45、疫抑制劑，與EBV同時(shí)加入時(shí)可有效地阻止T淋巴細(xì)胞對(duì)EBV的應(yīng)答反應(yīng)，防止已轉(zhuǎn)化的B 淋巴細(xì)胞受T 淋巴細(xì)胞攻擊而退化。EB 病毒一般感染B淋巴細(xì)胞，通過(guò)受體CD21進(jìn)入宿主細(xì)胞后可自行環(huán)化以游離體的形式長(zhǎng)期存在于宿主細(xì)胞體內(nèi)，形成潛伏感染。EB病毒潛伏感染人外周血 B 淋巴細(xì)胞后可活化B 淋巴細(xì)胞，促進(jìn)靜息期的B 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為永生化大量增殖的類淋巴母細(xì)胞系（LCL） 。實(shí)驗(yàn)性能EBV轉(zhuǎn)化結(jié)果轉(zhuǎn)化培養(yǎng)1 周后，倒置顯微鏡下觀察可見聚集的細(xì)胞團(tuán)塊，細(xì)胞透明發(fā)亮，體積明顯增大，細(xì)胞外壁有不規(guī)則毛刺狀突起，即為淋巴母細(xì)胞樣B 細(xì)胞；3 周后，鏡下可見轉(zhuǎn)化細(xì)胞克隆明顯增多；1 個(gè)月以后，細(xì)胞增殖旺盛，形

46、成生長(zhǎng)密集的大克隆，標(biāo)志轉(zhuǎn)化成功。凍存細(xì)胞復(fù)蘇后生長(zhǎng)情況分別于凍存10 d、 1 個(gè)月、 3 個(gè)月后進(jìn)行了復(fù)蘇，所有凍存后的細(xì)胞復(fù)蘇成功率都為100，復(fù)蘇后3d 即可傳代培養(yǎng)，鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)正常，所有細(xì)胞株依然保持旺盛的增殖特性，表明成功獲得永生細(xì)胞株。細(xì)胞生物學(xué)特性染色體核型分析：采用染色體核型分析技術(shù)比較轉(zhuǎn)化后永生細(xì)胞與來(lái)自同 個(gè)體新鮮外周血淋巴細(xì)胞染色體的G帶，未發(fā)現(xiàn)有任何變異，表明轉(zhuǎn)化后的B 淋巴細(xì)胞保留了正常的染色體核型，未發(fā)生畸變，即保留了原有細(xì)胞的遺傳特性。細(xì)胞表型分析：轉(zhuǎn)化后的細(xì)胞經(jīng)熒光抗體CD3 CD19。染色，用流式細(xì)胞儀分析，結(jié)果100表達(dá)成熟B淋巴細(xì)胞CD19。樣本類

47、型及受檢者準(zhǔn)備在無(wú)菌條件下采集靜脈血3ml（肝素抗凝，空腹為宜），立即送至實(shí)驗(yàn)室。儀器及耗材離心機(jī)，CO2培養(yǎng)箱，離心管（15ml， 50ml） ， 10ml 吸管，電動(dòng)槍，大中小Tip 頭及移液槍，25cm2培養(yǎng)瓶，0.22 m 針式過(guò)濾器，10ml 注射器，凍存液，凍存管。實(shí)驗(yàn)試劑1）環(huán)孢霉素：用無(wú)血清培養(yǎng)基RPMI-1640配制成200 g/ml ，分裝到小離心管中凍存于 -20 C，有效期2 個(gè)月。2）EB 病毒： B95-8 細(xì)胞常規(guī)接種至25cm2培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)，放置5-7 天不換液后方可凍存。將細(xì)胞與培養(yǎng)液一起放入一次性的15ml 離心管中，直接置-70 C冰箱保存。使用前將其取出

48、反復(fù)凍融三次。3）RPMI-1640 培養(yǎng)基，完全培養(yǎng)基：75ml RPMI-1640 加 25ml FBS， 無(wú)菌試驗(yàn)陰性后方可使用。4） 淋巴細(xì)胞分離液。5）凍存液的配制：25% FBS 1640 / DMSO =9/1 （ V:V）需使用前新鮮配制。操作步驟在離心管中將外周血用無(wú)血清RPMI-1640 按 1:1 稀釋， 另取一離心管，加入適量淋巴細(xì)胞分離液，然后用吸管將血液輕輕懸浮于淋巴細(xì)胞分離液上，注意不要將兩者混和，比例是2:1 。用水平離心機(jī)于20-25 C，離心2500rpm， 10分鐘。用吸管吸取淋巴細(xì)胞層到6-8ml 無(wú)血清的RPMI-1640中，并輕輕吹打淋巴細(xì)胞。洗脫：

49、室溫，離心1500rpm， 10分鐘。再洗脫：去掉上清，加6-8ml 無(wú)血清的1640重復(fù)步驟（4） 。棄上清，加2ml 的 25%FBS的完全培養(yǎng)基輕輕吹打細(xì)胞形成單個(gè)淋巴細(xì)胞懸液。接種于一個(gè)25cm2培養(yǎng)瓶中。再加入 40 l 環(huán)孢霉素和1.5mlEBV。側(cè)放在37 C， 5% CO2培養(yǎng)箱中開放式培養(yǎng)。待三天后觀察，如果細(xì)胞形態(tài)較好，培養(yǎng)基顏色變成金黃色，則細(xì)胞增殖明顯，可加入0.5ml 含 25%FBS的 1640于培養(yǎng)瓶中；如果細(xì)胞形態(tài)不好，瓶底可見一層紅細(xì)胞，鏡下可見成堆的死細(xì)胞碎片，則需要重新做分離，重新接種培養(yǎng)。以后每隔2-3 天需觀察一次，細(xì)胞處理視情況而定（原則上建株前一段

50、時(shí)間宜緩慢加培養(yǎng)基，并讓其液體保持偏酸性為佳）。待其培養(yǎng)基液體增加到10-15ml， 可選擇半量換液，細(xì)胞密度較大時(shí)則需要傳代。等細(xì)胞長(zhǎng)到50ml 左右，一般以1 106管凍存，復(fù)蘇檢測(cè)登記入庫(kù)。潛在變異來(lái)源建株用的外周血淋巴細(xì)胞放置不宜超過(guò)72小時(shí)， 最好時(shí)間段為12-24 小時(shí)，標(biāo)本可保存于室溫。分離淋巴細(xì)胞時(shí)，分離液和外周血不能混和，否則分離不好。EBV必須效價(jià)好，放-70 C保存不宜超過(guò)6個(gè)月。要注意細(xì)胞的密度，2ml 全血分離得到的淋巴細(xì)胞加2ml 培養(yǎng)基較宜。所有試劑用品必須分兩線使用，防止污染。建株前期細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)的原則是耐酸不耐堿。建株前期不能以肉眼或培養(yǎng)液的pH值來(lái)判斷細(xì)胞生

51、長(zhǎng)狀態(tài)，需要于鏡下觀察，防止錯(cuò)誤判斷。10環(huán)境和安全控制試劑中含有防腐劑和穩(wěn)定劑,不可直接接觸皮膚、眼睛、黏膜，一旦接觸，立即用大量清水沖洗；受檢標(biāo)本均應(yīng)假定含有傳染性病原菌，實(shí)驗(yàn)操作過(guò)程及廢棄物處理過(guò)程應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)室生物安全管理程序進(jìn)行處理；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)嚴(yán)格控制環(huán)境及實(shí)驗(yàn)儀器/設(shè)備的溫度、濕度等相關(guān)條件，以確保實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定。中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)國(guó)家 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室作業(yè)指導(dǎo)書文件編號(hào)版本 /修訂號(hào)4.4 骨髓細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備發(fā)布日期實(shí)施日期目的規(guī)范骨髓標(biāo)本細(xì)胞培養(yǎng)流程及染色體制備過(guò)程，為臨床骨髓細(xì)胞染色體核型分析提供質(zhì)量保證。測(cè)定方法5%CO培養(yǎng)2/ 手工收獲。測(cè)定原理骨髓染色體標(biāo)本制

52、備通常用于血液病患者，特別是慢性或急性粒細(xì)胞性白血病， 因?yàn)楣撬璺从沉Ｏ导?xì)胞增生情況。在不受外界抗原的刺激下，通過(guò)短期培養(yǎng)和直接制片法可以觀察到異常腫瘤細(xì)胞的核型。反映那些病理淋巴細(xì)胞的染色體改變，為臨床提供輔助診斷。性能特征經(jīng) G顯帶處理后可見300-550 條顯帶。樣本類型及受檢者準(zhǔn)備在無(wú)菌條件下1-2 毫升骨髓加入RPMI-1640液或Hanks液 8 毫升于 15ml一次性離心管中，立即送檢。肝素抗凝。實(shí)驗(yàn)耗材與儀器酒精燈，燒杯，天平，離心機(jī)，恒溫培養(yǎng)箱，冰盒，載玻片，玻片盒，光學(xué)顯微鏡，恒溫水浴箱，記時(shí)器，滅菌注射器(5ml) ，離心管，無(wú)菌吸管，量筒，培養(yǎng)瓶，試劑瓶等。8實(shí)驗(yàn)試劑完

53、全培養(yǎng)基：RPMI-1640 培養(yǎng)基4ml，小牛血清1ml，肝素0.05ml ，雙抗：青霉素和鏈霉素，終濃度為100U/ml， 最后用3.5%碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH為 7.2-7.4秋水仙素: 濃度 20 g/ml低滲液：0.075mol/L 的 KCl 溶液4) 卡諾固定液0.25% EDTA-trypsin ：A液：將 0.25g 的 trypsin 溶于 100ml 的 PBS中B液：另將0.02g 的EDTA溶于100的 PBS中0.25% EDTA-trypsin ： A:B=1:1（V/V）10ml 溫育液：1ml 0.25%的 0.25% EDTA-trypsin9ml 0.075 m

54、ol/LKCl9 實(shí)驗(yàn)步驟短期培養(yǎng)法從髂骨取骨髓液適量，1640 或Hank s 液離心洗脫2 次， 去除脂肪顆粒，無(wú)菌注入裝有5ml 培養(yǎng)液的培養(yǎng)瓶中，37培養(yǎng) 24-48 小時(shí)；加入秋水仙素（終濃度為0.04-0.08 g/ml ） ，繼續(xù)培養(yǎng)55分鐘，收獲；將標(biāo)本移入離心管，1500rpm離心10min，去上清，加入0.075mol/L的 KCl ， 37低滲30min；預(yù)固定：加固定液1.5ml ，輕混勻，水浴5分鐘；固定：加固定液至7ml，輕混勻，1500rpm，10min，去上清；再固定：加固定液至7ml ，輕混勻，1500rpm， 10min，去上清；視細(xì)胞量調(diào)整懸液，滴片，烤片

55、3 小時(shí)，顯帶。直接制備法取 1-2 毫升骨髓加入RPMI-1640液或Hank s 液 8 毫升混勻離心1500rpm， 10分鐘洗脫2次，去除脂肪顆粒。棄上清，加1 毫升 0.25%的胰酶與9 毫升 0.075 M KCl 混合液至10毫升吹打混勻；加秋水仙素（使終濃度為0.02g/ml ） ，混勻；放至水浴箱，37低滲30 分鐘；加 1.5ml 固定液預(yù)固定，水浴5 分鐘，輕混勻；1500rpm，室溫，10分鐘，去上清；加固定液至7 毫升，輕混勻；1500rpm，室溫，10分鐘，去上清；重復(fù)固定一次；（ 10）視細(xì)胞量調(diào)懸液，滴片，烤片3 小時(shí)，顯帶。10參考范圍染色體數(shù)目：46,XN

56、；染色體結(jié)構(gòu)：無(wú)明顯結(jié)構(gòu)異常。11 潛在變異來(lái)源不排除細(xì)胞培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)生突變的可能性，從而導(dǎo)致染色體數(shù)目或結(jié)構(gòu)改變，因此應(yīng)嚴(yán)格執(zhí)行2-3 線平行操作，以發(fā)現(xiàn)因培養(yǎng)過(guò)程導(dǎo)致的結(jié)果異常。接種所用器皿要進(jìn)行嚴(yán)格的滅菌處理。離心時(shí)，一定要注意離心機(jī)內(nèi)溫度，必須達(dá)到室溫方可離心。采取血液病病人骨髓標(biāo)本時(shí)注意無(wú)菌操作（被污染的骨髓將無(wú)法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)）骨髓采取量為1-2ml ，并注意抗凝。直接法主要用于急性白血病。12環(huán)境和安全控制試劑中含有防腐劑和穩(wěn)定劑, 請(qǐng)勿直接接觸皮膚、眼睛、黏膜，一旦接觸，立即用大量清水沖洗；受檢標(biāo)本均應(yīng)假定含有傳染性病原菌，其廢棄過(guò)程應(yīng)遵循實(shí)驗(yàn)室生物安全管理程序進(jìn)行處理；實(shí)驗(yàn)過(guò)程中應(yīng)

57、嚴(yán)格控制環(huán)境及實(shí)驗(yàn)儀器/設(shè)備的溫度、濕度等相關(guān)條件，以確保實(shí)驗(yàn)條件穩(wěn)定。中南大學(xué)湘 雅醫(yī)院醫(yī)學(xué) 遺傳學(xué)國(guó)家 重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室作業(yè)指導(dǎo)書文件編號(hào)版本 /修訂號(hào)4.5 人羊水細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備發(fā)布日期實(shí)施日期目的規(guī)范羊水標(biāo)本細(xì)胞培養(yǎng)及染色體制備過(guò)程，為臨床羊水細(xì)胞染色體核型分析可靠性提供質(zhì)量保證。測(cè)定方法CO2培養(yǎng)/手工收獲。測(cè)定原理人的羊水細(xì)胞能長(zhǎng)成單層并可連續(xù)進(jìn)行傳代培養(yǎng)，但它們的一些特征與一般成纖維細(xì)胞不同。在羊水中存在著各種不同類型的胎兒細(xì)胞，依據(jù)其外形和生長(zhǎng)特征可分為以下三類：上皮細(xì)胞（E） 、成纖維細(xì)胞（F）和羊水細(xì)胞（AF） 。 E 細(xì)胞在胰酶消化的連續(xù)培養(yǎng)中不再生長(zhǎng)，所以在培養(yǎng)過(guò)程中的

58、生長(zhǎng)期最短。AF細(xì)胞在培養(yǎng)初期就長(zhǎng)得很好，染色體分析大多用這類細(xì)胞。F 細(xì)胞在培養(yǎng)中的生長(zhǎng)期最長(zhǎng)，在較老的羊水培養(yǎng)物中占優(yōu)勢(shì)。通常在培養(yǎng)后3-4 天（可能更早些）即出現(xiàn)E 細(xì)胞的集落，它們不適合作染色體分析。大約在第7 天出現(xiàn)的AF細(xì)胞可用于染色體制備。如果在培養(yǎng)后第10 天還未見長(zhǎng)出新的細(xì)胞，就應(yīng)考慮第二次羊膜穿刺。性能特征經(jīng) G顯帶處理后可見300-550 條顯帶。樣本類型及受檢者準(zhǔn)備在無(wú)菌條件下抽得妊娠16-22+6 周羊水后，注入 15ml 一次性離心管中，約抽30ml，立即送檢。試劑完全培養(yǎng)基100ml：在超凈工作臺(tái)內(nèi)，用移液管將培養(yǎng)基和其他各試劑分裝入 100 毫升無(wú)菌瓶中（商業(yè)化

59、培養(yǎng)基或F10培養(yǎng)基70ml，胎牛血清30ml，雙抗：青霉素和鏈霉素，終濃度為100U/ml，用3.5%碳酸氫鈉調(diào)節(jié)pH為7.4 ） 。秋水仙素濃度：20 g/ml。低滲液：0.075mol/L 的 KCl溶液卡諾固定液0.25% EDTA-trypsin生理鹽水儀器及耗材酒精燈，燒杯，天平，離心機(jī)，CO2培養(yǎng)箱，冰盒，載玻片，玻片盒，光學(xué)顯微鏡，滅菌注射器（5ml） ，離心管，無(wú)菌吸管，量筒，培養(yǎng)瓶，試劑瓶等。操作程序細(xì)胞接種與培養(yǎng)在無(wú)菌條件下抽得妊娠16-22+6周羊水后，注入 15ml 一次性離心管中，約抽 30ml，立即送檢。以 1500rpm離心10min。進(jìn)接種培養(yǎng)室，在超凈工作臺(tái)

60、上吸去上清液，每管約留0.5ml ， 吸管打散細(xì)胞 。 制成細(xì)胞懸液，再加入約4.5ml 完全培養(yǎng)基入管內(nèi)，吸管充分混勻， TOC o 1-5 h z 移至25cm2方形培養(yǎng)瓶中，置含5%C2O的 37溫箱行開放式培養(yǎng)。一般 5天后鏡下觀察，可見成纖維樣或上皮細(xì)胞生長(zhǎng)，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)旺盛，在貼壁細(xì)胞層的背景上出現(xiàn)圓形細(xì) 胞時(shí)， 視情況 （有較好的梭形細(xì)胞 克隆）可換上完全培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24-48 小時(shí)， 如細(xì)胞生長(zhǎng)狀況好，即可加入秋水仙素0.04 -0.08 g/ml, （ 1ml注射器垂直加20 g/ml 秋水仙素2滴 ）4-6 小時(shí)左右后行細(xì)胞學(xué)處理。細(xì)胞收獲倒出瓶中細(xì)胞上清液入10ml 離