丹皮酚對(duì)MRC-5細(xì)胞的抗衰老和抑制HaCaT細(xì)胞的EMT作用

1、丹皮酚對(duì) MRC-5細(xì)胞的抗衰老和抑制HaCaT細(xì)胞的 EMT作用一、目的 : 衰老是生物界的普遍規(guī)律, 可以是正常組織細(xì)胞的正常老化, 也與冠心病、動(dòng)脈粥樣硬化、高血壓、糖尿病、肝損傷等疾病有密切關(guān)系, 這些疾病所導(dǎo)致的機(jī)體的免疫功能降低或者臟腑功能的衰竭, 從而引起器官、組織和細(xì)胞的快速衰老 ; 其中衰老與癌癥死亡率也隨年齡增加而呈指數(shù)遞增的關(guān)系, 尤其是60 歲以上的人群 ; 此外衰老細(xì)胞能顯著分泌多種炎癥因子, 趨化因子 , 生長(zhǎng)因子等 , 這種分泌形式統(tǒng)稱為衰老相關(guān)的分泌表型（ SASP）,SASP可以泌炎癥及癌基因相關(guān)因子促進(jìn)永生化的上皮細(xì)胞惡性增殖、遷移和侵襲 , 誘導(dǎo)上皮細(xì)胞發(fā)

2、生惡性轉(zhuǎn)化和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（ EMT）。在 80 年代早期 ,EMT首次被人們發(fā)現(xiàn)并且逐漸被人們所重視 , 很多研究發(fā)現(xiàn)上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有著密切的關(guān)系。EMT是上皮細(xì)胞獲得遷移能力的一種方式 , 近年來(lái) ,EMT在腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移過(guò)程中被人們所認(rèn)識(shí)且越來(lái)越被關(guān)注。 通過(guò)上皮 - 間質(zhì)轉(zhuǎn)分化 , 細(xì)胞失去其本身的極性 , 而且也失去了與基底膜之間的連接 , 使腫瘤細(xì)胞獲得了抗凋亡以及降解細(xì)胞外基質(zhì)的能力 , 從而具有很高的遷移及侵襲等間質(zhì)的表型。目前 ,EMT已被大多數(shù)人認(rèn)為是導(dǎo)致惡性腫瘤發(fā)生侵襲與轉(zhuǎn)移的重要因素。本實(shí)驗(yàn)首先利用 H2O2誘導(dǎo)人肺胚成纖維細(xì)胞 MRC-5發(fā)生衰老 , 而衰

3、老的 MRC-5細(xì)胞的分泌上清里包含著 SASP,其里面的炎性因子（ IL-6/IL-8）可以促進(jìn)人永生化細(xì)胞HaCaTKeratinocytescells （HaCaT細(xì)胞）發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化 , 從而導(dǎo)致 HaCaT細(xì)胞發(fā)生 EMT。故本實(shí)驗(yàn)首先探討丹皮酚對(duì)MRC-5細(xì)胞的抗衰老作用與機(jī)制, 接著利用衰老MRC-5細(xì)胞的分泌上清誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞發(fā)生 EMT,最后研究丹皮酚對(duì)HaCaT細(xì)胞EMT的作用及機(jī)制。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果證明了丹皮酚可以通過(guò)抗氧化應(yīng)激和抑制EMT的作用 , 從而發(fā)揮其抗衰老和抑制惡性轉(zhuǎn)化的功效。二、方法 :1 、丹皮酚對(duì) H2O2所誘導(dǎo)衰老的人肺胚成纖維細(xì)胞 MRC-5的影響（

4、1）MTT法檢測(cè) 0120 MH2O2對(duì)人肺胚成纖維細(xì)胞MRC-5活性的影響 , 并篩選合適的濃度用于誘導(dǎo)MRC-5細(xì)胞衰老。此后 , 檢測(cè) 0150 M丹皮酚對(duì)H2O2所誘導(dǎo)衰老的人肺胚成纖維細(xì)胞MRC-5生長(zhǎng)的影響 , 根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果確定有效的丹皮酚濃度用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)的研究。（2）衰老相關(guān) - 半乳糖苷酶檢測(cè) H2O2（40,60,80 M）所誘導(dǎo)的人肺胚成纖維細(xì)胞MRC-5的衰老程度 , 并確定最為合適的H2O2濃度 , 以及之后丹皮酚（ 60,90,120 M）對(duì) 60 MH2O2誘導(dǎo)的人肺胚成纖維細(xì)胞MRC-5衰老的影響。（3）流式細(xì)胞儀檢測(cè)丹皮酚對(duì)60 M H2O2所誘導(dǎo)衰老的人肺胚成

5、纖維細(xì)胞MRC-5的活性氧（ ROS）活性和細(xì)胞周期的影響。（4）丹皮酚和 Vit E 對(duì) 60 M H2O2所誘導(dǎo)衰老的人肺胚成纖維細(xì)胞MRC-5給藥 24 h 后, 使用胰酶消化細(xì)胞后 , 收集消化下來(lái)的細(xì)胞 , 用 RIPA加 PMSF裂解細(xì)胞后提取處理過(guò)的總蛋白并且定量。采用 Western blot檢測(cè)蛋白衰老相關(guān)蛋白p16,p53,Id-1,p21,以及抗氧化相關(guān)蛋白HO-1,Nrf2,CAT,SOD,NQO-1的表達(dá)情況。2、丹皮酚對(duì)衰老的人肺胚成纖維細(xì)胞MRC-5的分泌上清誘導(dǎo)的EMT的影響1）克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)丹皮酚對(duì)衰老的 MRC-5細(xì)胞分泌上清誘導(dǎo)的 HaCaT細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化

6、程度。（2）ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)丹皮酚對(duì)衰老的 MRC-5細(xì)胞分泌上清誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞的細(xì)胞上清中IL-6/IL-8水平影響。（3）免疫熒光法檢測(cè)丹皮酚對(duì)衰老的MRC-5細(xì)胞分泌上清誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞中 EMT上皮間質(zhì)蛋白 Vimentin 的蛋白表達(dá)影響。（4）劃痕方法和 Transwell 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)丹皮酚對(duì)衰老的 MRC-5細(xì)胞分泌上清誘導(dǎo)的 HaCaT細(xì)胞侵襲和遷移能力的影響。（5）Western blot 檢測(cè) EMT上皮標(biāo)志物 E-cadherin,EMT 間質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin,-SMA,以及轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)蛋白-catenin,Snai1,TGF-1,COX-2,MMP-

7、1,ERK1/2,p-ERK1/2,Smad2,Smad3,p-Smad2,p-Smad3的表達(dá)情況 ,重點(diǎn)研究丹皮酚調(diào)節(jié)ERK1/2 和 TGF-1/Smad 通路的作用。三、結(jié)果 :1 、丹皮酚對(duì) H2O2誘導(dǎo)的衰老的成纖維細(xì)胞 MRC-5的抗衰老作用（ 1）MTT結(jié)果顯示 :40,60,80 M的 H2O2對(duì)人肺胚成纖維細(xì)胞 MRC-5活性有明顯抑制的作用并且不會(huì)殺傷細(xì)胞 ; 與 60 M H2O2組相比 , 隨著丹皮酚藥物濃度（ 60,90,120 M）的增加 ,H2O2誘導(dǎo)的 MRC-5細(xì)胞活性有明顯的增加作用 ,并具有濃度依賴性。（2）衰老相關(guān) - 半乳糖苷酶實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示, 與正常

8、組相比 ,60 MH2O2濃度 ,MRC-5細(xì)胞染上藍(lán)色的數(shù)目最多, 且細(xì)胞活性較好 , 即 - 半乳糖苷酶的陽(yáng)性率高 , 細(xì)胞衰老的程度高 ; 與 60MH2O2組相比 , 隨著丹皮酚藥物濃度（ 60,90,120 M）的增加 ,H2O2誘導(dǎo)的 MRC-5細(xì)胞的衰老程度明顯降低, 并具有濃度依賴性。（3）流式細(xì)胞儀檢測(cè)MRC-5細(xì)胞周期的結(jié)果顯示 : 與正常組相比 ,60 M H2O2使 MRC-5細(xì)胞周期生長(zhǎng)期 S 期顯著減少 ,MRC-5細(xì)胞呈衰老狀態(tài)。與 H2O2組相比 , 隨著丹皮酚藥物濃度（ 60,90,120M）的增加 , 可以增加衰老的 MRC-5細(xì)胞細(xì)胞周期的 S 期, 促進(jìn)

9、細(xì)胞增殖活力 ,并具有濃度依賴性。（ 4）流式細(xì)胞儀檢測(cè)活性氧ROS的結(jié)果顯示 : 與正常組相比 ,60 MH2O2促使 MRC-5細(xì)胞產(chǎn)生較多活性氧 （ROS）,細(xì)胞氧化的程度較高。與 60M H2O2組相比 , 隨著丹皮酚藥物濃度60,90,120 M）的增加 , 活性氧（ ROS）呈濃度依賴性降低 , 顯著減緩 MRC-5細(xì)胞的氧化程度。（5）Western blot 檢測(cè)結(jié)果顯示 , 與正常組相比 ,H2O2組中的衰老相關(guān)蛋白 p16,p21,p53 及氧化相關(guān)蛋白 Nrf2,HO-1,CAT,SOD,NQO-1表達(dá)水平升高 ,Id-1 表達(dá)水平降低 ,MRC-5細(xì)胞衰老和氧化的程度增

10、高。與 H2O2組相比 , 隨著丹皮酚藥物濃度（ 60,90,120 M）的增加 , 衰老相關(guān)蛋白 p16,p21,p53 及氧化相關(guān)蛋白Nrf2,HO-1,CAT,SOD,NQO-1表達(dá)水平明顯降低 ,Id-1表達(dá)水平升高 ,MRC-5細(xì)胞的衰老和氧化程度減緩 , 并具有濃度依賴性。 2、丹皮酚對(duì)衰老 MRC-5細(xì)胞的分泌上清誘導(dǎo)的 HaCaT細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)分化（ EMT）的作用及機(jī)制探討（ 1）克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 , 與正常的 MRC-5細(xì)胞的分泌上清孵育的HaCa T細(xì)胞對(duì)照組相比 , 衰老的 MRC-5細(xì)胞的分泌上清孵育的HaCaT細(xì)胞模型組 , 細(xì)胞的克隆形成能力明顯增加。與模型組

11、相比 , 丹皮酚（60,90,120 M）孵育的模型組的克隆形成能力降低,且在 120 M時(shí) HaCaT細(xì)胞克隆形成能力接近對(duì)照組。 （ 2）ELISA 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 ,與正常的 MRC-5細(xì)胞的分泌上清孵育的HaCaT細(xì)胞對(duì)照組相比 , 衰老的 MRC-5細(xì)胞的分泌上清孵育的HaCaT細(xì)胞模型組的細(xì)胞的SASP（IL-6/IL-8）明顯增加。與模型組相比 , 丹皮酚（60,90,120 M）孵育的模型組的SASP（IL-6/IL-8）明顯降低 , 且在 120M時(shí) HaCaT細(xì)胞上清的 IL-6/IL-8接近對(duì)照組。（3）免疫熒光結(jié)果顯示 : 與正常的 MRC-5細(xì)胞的分泌上清孵育的HaCa

12、T對(duì)照組相比 , 衰老的MRC-5細(xì)胞的分泌上清孵育的HaCaT細(xì)胞模型組 EMT上皮間質(zhì)蛋白 Vimentin 的蛋白表達(dá)明顯增加。與模型組相比 , 丹皮酚（120 M）孵育的模型組的Vimentin 和 Snail的蛋白表達(dá)明顯降低。（4）劃痕方法結(jié)果顯示 : 與正常的 MRC-5細(xì)胞的分泌上清孵育的HaCaT對(duì)照組相比 , 衰老的 MRC-5細(xì)胞的分泌上清孵育的HaCaT模型組的細(xì)胞的遷移能力明顯增加。與模型組相比 , 丹皮酚（60,90,120 M）孵育的模型組的遷移能力降低, 且在120 M時(shí) HaCaT細(xì)胞遷移能力接近對(duì)照組。 （5）Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 : 與正常的 M

13、RC-5細(xì)胞的分泌上清孵育的HaCaT 對(duì)照組相比 , 衰老的 MRC-5細(xì)胞的分泌上清孵育的 HaCaT模型組的細(xì)胞的侵襲能力明顯增加。與模型組相比 , 丹皮酚（60,90,120 M）孵育的模型組的侵襲能力降低, 且在120 M時(shí) HaCaT細(xì)胞侵襲能力接近對(duì)照組。 （6）Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示 ,與正常的 MRC-5細(xì)胞的分泌上清孵育的HaCaT對(duì)照組相比 , 衰老的 MRC-5細(xì)胞的分泌上清孵育的HaCaT模型組的細(xì)胞的EMT上皮標(biāo)志物 E-cadherin表達(dá)明顯下調(diào) ; 同時(shí) EMT間質(zhì)標(biāo)志物 N-cadherin, -SMA表達(dá)也顯著上升 , 轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)蛋白 -

14、catenin,Snai1,TGF- 1,COX-2,MMP-1,p-ERK1/2,p-Smad2,p-Smad3表達(dá)增加。與模型組相比 , 丹皮酚（ 60,90,120 M）孵育的 HaCaT模型組細(xì)胞 ,EMT上皮標(biāo)志物 E-cadherin 表達(dá)明顯上升 ; 同時(shí) EMT間質(zhì)標(biāo)志物 N-cadherin, -SMA表達(dá)顯著下降 , 轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)錄因子和相關(guān)蛋白 -catenin,Snai1,TGF-1,COX-2,MMP-1,p-ERK1/2,p-Smad2,p-Smad3表達(dá)降低。表明丹皮酚通過(guò)調(diào)節(jié)ERK和 TGF-1/Smad相關(guān)信號(hào)通路抑制 HaCaT細(xì)胞的 EMT。四、結(jié)論 :1 、在抗 MRC-5細(xì)胞衰老的實(shí)驗(yàn)中 , 丹皮酚對(duì)H2O2誘導(dǎo)的 MRC-5細(xì)胞衰老模型具有較強(qiáng)的抗衰老作用 , 結(jié)果表明丹皮酚通過(guò)調(diào)節(jié)抗氧化Nrf2 通路 , 以及抗衰老 p16/Id-1和 p53/p21通路來(lái)逆轉(zhuǎn) H2O2誘導(dǎo)的 MRC-5細(xì)胞氧化和衰老。 2、在抑制 HaCaT細(xì)胞 EMT實(shí)驗(yàn)中 , 實(shí)驗(yàn)結(jié)