反膠束萃取精品課件

1、反膠束萃取第1頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二10.1 反膠束溶液形成的條件和特性優(yōu)點(diǎn)：從所得結(jié)果來看，反膠束萃取具有成本低、溶劑可反復(fù)使用、萃取率和反萃取率都很高等突出的優(yōu)點(diǎn)。此外，反膠束萃取還有可能解決外源蛋白的降解，即蛋白質(zhì)(胞內(nèi)酶)在非細(xì)胞環(huán)境中迅速失活的問題，而且由于構(gòu)成反膠束的表面活性劑往往具有溶解細(xì)胞的能力，因此可用于直接從整細(xì)胞中提取蛋白質(zhì)和酶。可見，反膠束萃取技術(shù)為蛋白質(zhì)的分離提取開辟了一條具有工業(yè)開發(fā)前景的新途徑。反膠束溶液的概念：反膠束溶液是透明的、熱力學(xué)穩(wěn)定的系統(tǒng)。反膠束(reversed micelle)是表面活性劑分散于連續(xù)有機(jī)相中一種自發(fā)形成

2、的納米尺度的聚集體，所以表面活性劑是反膠束溶液形成的關(guān)鍵。第2頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二10.1.1 表面活性劑表面活性劑是由親水憎油的極性基團(tuán)和親油憎水的非極性基團(tuán)兩部分組成的兩性分子，可分為陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑和非離子型表面活性劑，它們都可用于形成反膠束。常用的表面活性劑及相應(yīng)的有機(jī)溶劑見表10.1。在反膠束萃取蛋白質(zhì)的研究中，用得最多的是陰離子表面活性劑AOT(AerosolOT)，其化學(xué)名為丁二酸2乙基己基磺酸鈉，結(jié)構(gòu)式見圖第3頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二這種表面活性劑容易獲得，其特點(diǎn)是具有雙鏈，極性基團(tuán)較小、形成反膠

3、束時(shí)不需加助表面活性劑，并且所形成的反膠束較大，半徑為170nm，有利于大分子蛋白質(zhì)進(jìn)入。常使用的陽離子表面活性劑名稱和結(jié)構(gòu)如下：(1)CTAB(cetyl-methyl-ammonium bromide)溴化十六烷基三甲胺/十六烷基三甲基胺溴(2)DDAB(didodecyldimethyl ammonium bromide)溴化十二烷基二甲銨第4頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二(3) TOMAC (triomethyl-ammonium chloride)氯化三辛基甲銨 將陽離子表面活性劑如CTAB溶于有機(jī)溶劑形成反膠束時(shí)，與AOT不同，還需加入一定量的助溶劑(助表面

4、活性劑)。這是因?yàn)樗鼈冊诮Y(jié)構(gòu)上的差異造成的。第5頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二 臨界膠束濃度(Critical Micelle Concentration CMC) 臨界膠束濃度,是膠束形成時(shí)所需表面活性劑的最低濃度，用CMC來表示，這是體系特性，與表面活性劑的化學(xué)結(jié)構(gòu)、溶劑、溫度和壓力等因素有關(guān)。CMC的數(shù)值可通過測定各種物理性質(zhì)的突變(如表面張力、滲透壓等)來確定。由于實(shí)驗(yàn)方法不同，所得的CMC值往往難于完全一致，但是突變點(diǎn)總是落在一個(gè)很窄的濃度范圍內(nèi)，故用CMC范圍來表示更為方便。10.1.3 膠束與反放束的形成將表面活性劑溶于水中，當(dāng)其濃度超過臨界膠束濃度(CM

5、C)時(shí)，表面活性劑就會在水溶液中聚集在一起而形成聚集體，在通常情況下，這種聚集體是水溶液中的膠束，稱為正常膠束(normal micelle)。結(jié)構(gòu)示意見圖a。在膠束中，表面活性劑的排列方向是極性基團(tuán)在外，與第6頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二水接觸，非極性基團(tuán)在內(nèi)，形成一個(gè)非極性的核心、在此核心可以溶解非極性物質(zhì)。若將表面活性劑溶于非極性的有機(jī)溶劑中，并使其濃度超過臨界膠束濃度(CMC)，便會在有機(jī)溶劑內(nèi)形成聚集體，這種聚集體稱為反膠束，其結(jié)構(gòu)示意見圖b。在反膠束中，表面活性劑的非極性基團(tuán)在外與非極性的有機(jī)溶劑接觸，而極性基團(tuán)則排列在內(nèi)形成一個(gè)極性核(po1ar cor

6、e)。此極性核具有溶解極性物質(zhì)的能力，極性核溶解水后，就形成了“水池”(water pool)。當(dāng)含有此種反膠束的有機(jī)溶劑與蛋白質(zhì)的水溶液接觸后，蛋白質(zhì)及其他親水物質(zhì)能夠通過螯合作用進(jìn)入此“水池”。由于周圍水層和極性基團(tuán)的保護(hù)，保持了蛋白質(zhì)的天然構(gòu)型，不會造成失活。蛋白質(zhì)的溶解過程和溶解后的情況示意于圖中。第7頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二bac反膠團(tuán)的大小與溶劑和表面活性劑的種類與濃度、溫度、離子強(qiáng)度等因素有關(guān)，一般為520nm，其內(nèi)水池的直徑d用下式計(jì)算第8頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二d=6W0MsurfNW0有機(jī)相中水與表面活性劑的摩爾比

7、，稱為含水率（water content）M，分別為水的相對分子質(zhì)量和密度 surf界面處一個(gè)表面活性劑分子的面積N阿佛加德羅常數(shù)常用于制備反膠團(tuán)溶液的表面活性劑是二(2乙基己基)琥珀酸酯磺酸鈉，AOT在異辛烷中形成的反膠團(tuán)直徑(d)可用下述經(jīng)驗(yàn)式推算d =0.3W0+0.24 (nm)第9頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二式中右側(cè)第一項(xiàng)為反膠團(tuán)的水核直徑，第二項(xiàng)(2.4nm)為AOT分子長度的二倍。一般反膠團(tuán)的W0不超過40。因此，AOT形成的反膠團(tuán)水核直徑一般不超過l 2nm，其中大致可容納一個(gè)直徑為510 nm的蛋白質(zhì)。當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)分子與反膠團(tuán)直徑相比大得多時(shí)(例如，當(dāng)相

8、對分子質(zhì)量超過100200kD)，難于溶解到反膠團(tuán)中。 當(dāng)反膠團(tuán)的含水率W0較低時(shí)，反膠團(tuán)水池內(nèi)水的理化性質(zhì)與正常水相差懸殊。例如，以AOT為表面活性劑，當(dāng)W06-8時(shí)，反膠團(tuán)內(nèi)微水相的水分子受表面活性劑親水基團(tuán)的強(qiáng)烈束縛，表觀粘度上升50倍，疏水性也極高。隨W0的增大，這些現(xiàn)象逐漸減弱，當(dāng)W016時(shí)，微水相的水與正常的水接近，反膠團(tuán)內(nèi)可形成雙電層。但即使當(dāng)W0值很大時(shí)，水池內(nèi)水的理化性質(zhì)也不能與正常的水完全相同，特別是在接近表面活性劑親水頭的區(qū)域內(nèi)。第10頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二10.1.4 反膠團(tuán)的溶解作用由于反膠團(tuán)內(nèi)存在微水池，故可溶解氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生

9、物分子，為生物分子提供易于生存的親水微環(huán)境。因此，反膠團(tuán)萃取可用于氨基酸、肽和蛋白質(zhì)等生物分子的分離純化，特別是蛋白質(zhì)類生物大分子。關(guān)于反膠團(tuán)溶解蛋白質(zhì)的形式，有人提出了四種模型，如圖所示。其中(a)為水殼模型，蛋白質(zhì)位于水池的中心，周圍存在的水層將其與反膠團(tuán)壁(表面活性劑)隔開；(b)蛋白質(zhì)分子表面存在強(qiáng)烈疏水區(qū)域，該疏水區(qū)域直接與有機(jī)相接觸；(c)蛋白質(zhì)吸附于反膠團(tuán)內(nèi)壁；(d)蛋白質(zhì)的疏水區(qū)與幾個(gè)反膠團(tuán)的表面活性劑疏水尾發(fā)生相互作用，被幾個(gè)小反膠團(tuán)所“溶解”。表面性質(zhì)不同的蛋白質(zhì)可能以不同的形式溶解于反膠團(tuán)相，但對于親水性蛋白質(zhì)，目前普遍接受的是水殼模型。第11頁，共29頁，2022年，5

10、月20日，4點(diǎn)6分，星期二因?yàn)樵S多實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均間接地證明了水殼模型的正確性。例如：(1)反膠團(tuán)內(nèi)酶的結(jié)構(gòu)和活性與W0值密切相關(guān)，說明酶對其周圍存在的水層非常敏感；(2)反膠團(tuán)內(nèi)酶反應(yīng)動(dòng)力學(xué)行為與在正常的水相中相似，活性與pH的關(guān)系同樣表現(xiàn)為鐘狀曲線。bcda反膠團(tuán)的溶解作用第12頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二10.2 反膠束萃取蛋白質(zhì)的基本原理 三元相圖及萃取蛋白質(zhì) 對一個(gè)由水、表面活性劑和非極性有機(jī)溶劑構(gòu)成的三元系統(tǒng)，存在有多種共存相，可用三元相圖表示，圖是水AOT異辛烷系統(tǒng)的相圖示例，從圖中可知，能用于蛋白質(zhì)分離的僅是位于底部的兩相區(qū)，在此區(qū)內(nèi)的三元混合物分為平衡的兩

11、相：一相是含有極少量有機(jī)溶劑和表面活性劑的水相；另一相是作為萃取劑的反膠束溶液。這共存的兩相組成，用系線(圖中虛線)相連。這一體系的物理化學(xué)性質(zhì)非常適合于萃取操作，因?yàn)榻缑鎻埩υ?.12mN/m范圍內(nèi)，密度差為10-20，反膠束溶液粘度適中，大約為1mPas這一數(shù)量級。蛋白質(zhì)進(jìn)入反膠束溶液是一種協(xié)同過程，即在宏觀兩相(有機(jī)相和水相)界面間的表面活性劑層，同鄰近的蛋白質(zhì)發(fā)生第13頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二靜電作用而變形，接著在兩相界面形成了包含有蛋白質(zhì)的反膠束，此反膠束擴(kuò)散進(jìn)入有機(jī)相中，從而實(shí)現(xiàn)了蛋白質(zhì)的萃取，其萃取過程和萃取后的情況見圖， 改變水相條件(如pH值和離

12、子種類及其強(qiáng)度等)又可使蛋白質(zhì)由有機(jī)相重新返回水相實(shí)現(xiàn)反萃取過程。水AOT異辛烷系統(tǒng)相圖反膠束萃取蛋白質(zhì)的示意團(tuán)第14頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二 蛋白質(zhì)溶入反膠束溶液的推動(dòng)力與分配特性 蛋白質(zhì)溶入反膠束溶液的推動(dòng)力主要包括表面活性劑與蛋白質(zhì)的靜電作用力和位阻效應(yīng)。(1)靜電作用力： 在反膠束萃取體系中，表面活性劑與蛋白質(zhì)都是帶電的分子，因此靜電相互作用肯定是萃取過程中的一種推動(dòng)力。其中一個(gè)最直接的因素是pH值，它決定了蛋白質(zhì)帶電基團(tuán)的離解速率及蛋白質(zhì)的凈電荷。當(dāng)pHpI時(shí)，蛋白質(zhì)呈電中性；pHpI時(shí)，蛋白質(zhì)帶正電荷；pHpI時(shí)，蛋白質(zhì)帶負(fù)電荷，即隨著pH的改變，被萃

13、取蛋白質(zhì)所帶電荷的符號和多少是不同的。因此，如果靜電作用是蛋白質(zhì)增溶過程的主要推動(dòng)力，對于陽離子表面活性劑形成的反膠束體系，萃取只發(fā)生在水溶液的pHpI時(shí)，此時(shí)蛋白質(zhì)與表面活性劑極性頭間相互吸引，而pHpI時(shí)，靜電排斥將抑制蛋白質(zhì)的萃取，對于 推動(dòng)力第15頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二陰離子表面活性劑形成的反膠束體系，情況正好相反。此外，離子型表面活性劑的反離子并不都固定在反膠束表面，對于AOT反膠束，約有30的反離子處于解離狀態(tài)，同時(shí)，在反膠束“水池”內(nèi)的離子和主體水相中的離子會進(jìn)行交換，這樣，在萃取時(shí)會同蛋白質(zhì)分子競爭表面活性劑離子，從而降低了蛋白質(zhì)和表面活性劑的靜

14、電作用力。另一種解釋則認(rèn)為離子強(qiáng)度(鹽濃度)影響蛋白質(zhì)與表面活性劑極性頭之間的靜電作用力是由于離解的反離子在表面活性劑極性頭附近建立了雙電層，稱為德拜屏蔽，從而縮短了靜電吸引力的作用范圈，抑制了蛋白質(zhì)的萃取，因此在萃取時(shí)要盡量避免后者的影響。(2)位阻效應(yīng) 許多親水性物質(zhì)，如蛋白質(zhì)、核酸及氨基酸等，都可以通過溶入反膠束“水池”來達(dá)到它們?nèi)苡诜撬軇┲械哪康?，但是反膠束“水池”的物理性(大小、第16頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二形狀等)及其中水的活度是可以用W0的變化來調(diào)節(jié)的，并且會影響大分子如蛋白質(zhì)的增溶或排斥，達(dá)到選擇性萃取的目的，這就是所謂的位阻效應(yīng)。 反膠束萃取中

15、蛋白質(zhì)的分配特性蛋白質(zhì)在兩相間的分配系數(shù)反膠束濃度M與表面活性劑濃度Ssurf的關(guān)系為M= Ssurf/N (N為聚焦數(shù))第17頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二 反膠束萃取蛋白質(zhì)的動(dòng)力學(xué)萃取過程中，蛋白質(zhì)在互不相溶的兩相間的傳遞可分為三步：蛋白質(zhì)從水溶液主體擴(kuò)散到界面；在界面形成包容蛋白質(zhì)的反膠束；含有蛋白質(zhì)的反膠束在有機(jī)相中擴(kuò)散離開界面。反萃取過程則相反，含有蛋白質(zhì)的反膠束從有機(jī)相主體擴(kuò)散到界面；包容蛋白質(zhì)的反膠束在界面崩裂；蛋白質(zhì)從界面擴(kuò)散到水溶液主體。蛋白質(zhì)進(jìn)入或離開反膠束相的傳遞通量可用下式計(jì)算：萃取過程反萃取過程第18頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6

16、分，星期二10.3 影響反膠束萃取蛋白質(zhì)的主要因素上式上式蛋白質(zhì)的萃取，與蛋白質(zhì)的表面電荷和反膠束內(nèi)表面電荷間的靜電作用，以及反膠束的大小有關(guān)，所以，任何可以增強(qiáng)這種靜電作用或?qū)е滦纬奢^大的反膠束的因素，都有助于蛋白質(zhì)的萃取。影響反膠束萃取蛋白質(zhì)的主要因素，見下表，只要通過對這些因素進(jìn)行系統(tǒng)的研究，確定最佳操作條件，就可得到合適的目標(biāo)蛋白質(zhì)萃取率，從而達(dá)到分離純化的目的。第19頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二 水相pH值對萃取的影響水相的pH值決定了蛋白質(zhì)表面電荷的狀態(tài)、從而對萃取過程造成影響。只有當(dāng)反膠束內(nèi)表面電荷，也就是表面活性劑極性基團(tuán)所帶的電荷與蛋白質(zhì)表面電荷相反

17、時(shí)，兩者產(chǎn)生靜電引力，蛋白質(zhì)才有可能進(jìn)入反膠束。故第20頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二對于陽離子表面活性劑、溶液的pH值需高于蛋白質(zhì)的pI值，反膠束萃取才能進(jìn)行；對于陰離子表面活性劑，當(dāng)pHpI時(shí)，萃取率幾乎為零，當(dāng)pHpI時(shí)，萃取率急劇提高，這表明蛋白質(zhì)所帶的凈電荷與表面活性劑極性頭所帶電荷符號相反，兩者的靜電作用對萃取蛋白質(zhì)有利，如果pH值很低，在界面上會產(chǎn)生白色絮凝物，并且萃取率也降低這種情況可認(rèn)為是蛋白質(zhì)變性之故。水相pH值對幾種相對分子質(zhì)量較小的蛋白質(zhì)的萃取影響見圖。對不同相對分子質(zhì)量的蛋白質(zhì)，pH值對萃取率的影響有差異性，當(dāng)?shù)鞍踪|(zhì)相對分子質(zhì)量增加時(shí)，只有增大

18、(pH-PI)值的絕對值，相轉(zhuǎn)移才能順利完成，如-糜蛋白酶(相對分子質(zhì)量為25000)的萃取率在pH值低于pI值2-4時(shí)達(dá)到最高，而牛血清蛋白(相對分子質(zhì)量為68000)在相同的系統(tǒng)中根本不發(fā)生相轉(zhuǎn)移。這種差異性可解釋為：對于包含大蛋白分子的反膠束，其尺寸第21頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二遠(yuǎn)大于“空核”的反膠束，萃取時(shí)勢必要消耗較多的能量，這些能量只能通過較強(qiáng)的靜電相互作用得到補(bǔ)償。用調(diào)節(jié)pH的作用來增加蛋白質(zhì)分子表面電荷的方法，正是達(dá)到增強(qiáng)靜電作用的一條途徑。對那些尺寸小于“空核”的反膠束中水體積的蛋白質(zhì)，只要其所攜帶的凈電荷與表面活性劑電性相反，萃取就能發(fā)生。蛋白

19、質(zhì)的相對分子質(zhì)量Mr與(pH-pI)絕對值呈線性關(guān)系,見圖,這種關(guān)系，對陰離子及陽離子表面活性劑所形成的反膠束體系同樣適用。第22頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二第23頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二 離子強(qiáng)度對萃取率的影響離子強(qiáng)度對萃取率的影響主要是由離子對表面電荷的屏蔽作用所決定的：a.離子強(qiáng)度增大后，反膠束內(nèi)表面的雙電層變薄，減弱了蛋白質(zhì)與反膠束內(nèi)表面之間的靜電吸引，從而減少蛋白質(zhì)的溶解度；b.反膠束內(nèi)表面的雙電層變薄后，也減弱了表面活性劑極性基團(tuán)之間的斥力，使反膠束變小，從而使蛋白質(zhì)不能進(jìn)入其中；c.離子強(qiáng)度增加時(shí)，增大了離子向反膠束內(nèi)“水池

20、”的遷移并取代其中蛋白質(zhì)的傾向，使蛋白質(zhì)從反膠束內(nèi)被鹽析出來；d.鹽與蛋白質(zhì)或表面活性劑的相互作用，可以改變?nèi)芙庑阅埽}的濃度越高，其影響就越大。如離子強(qiáng)(KCl 濃度)對萃取核糖酸酶a,細(xì)胞色素c和溶菌酶的影響見圖,由圖可見，在較低的KCl濃度下，蛋白質(zhì)幾乎全部被萃取，當(dāng)KCl濃度高于一定值時(shí),萃取率就開始下降，直至幾乎為零。當(dāng)然，不同蛋白質(zhì)開始下降時(shí)的KCl濃度第24頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二是不同的。第25頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二 表面活性劑類型的影響:前面已經(jīng)提到陰離子表面活性劑、陽離子表面活性劑和非離子表面活性劑都可用于形成反

21、膠束，關(guān)鍵是應(yīng)從反膠束萃取蛋白質(zhì)的機(jī)理出發(fā)，選用有利于增強(qiáng)蛋白質(zhì)表面電荷與反膠束內(nèi)表面電荷間的靜電作用和增加反膠束大小的表面活性劑，除此以外，還應(yīng)考慮形成反膠束及使反膠束變大(由于蛋白質(zhì)的進(jìn)入)所需的能量的大小、反膠束內(nèi)表面的電荷密度等因素，這些都會對萃取產(chǎn)生影響。 目前研究中常用的AOT反膠束體系和其他體系有許多不足，如不能用于分子量較大的蛋白質(zhì)的萃取和往往在兩相界面上形成不溶性的膜狀物等等，為克服這些不足,可通過在單一表面活性劑中加入具有親和作用的生物表面活性劑或另一種非離子型表面活性劑的方法來改善萃取性能。第26頁，共29頁，2022年，5月20日，4點(diǎn)6分，星期二 表面活性劑濃度的影響增大表面活性劑的濃度可增加反膠束的數(shù)