分子生物學實驗6瓊脂糖凝膠電泳

1、實驗六 瓊脂糖凝膠電泳2015-04-09實驗目的學習和掌握瓊脂糖凝膠電泳進行DNA檢測的方法；了解電泳過程中各種因素對結果的影響。瓊脂糖 ( Agarose ) 是一種線性多糖聚合物 ,主要成分為多聚半乳糖，是從紅色海藻產(chǎn)物瓊脂中提取而來的。當瓊脂糖溶液加熱到沸點后冷卻凝固便會形成良好的電泳介質 , 其密度是由瓊脂糖的濃度決定的。經(jīng)過化學修飾的低熔點 (LMP) 的瓊脂糖 , 在結構上比較脆弱 , 因此在較低的溫度下便會熔化 , 可作為介質用于電泳。實驗原理瓊脂糖凝膠電泳兼有“分子篩”和“電荷”的雙重效應。因此，不同分子量以及相同分子量但構型不同的核酸在瓊脂糖凝膠電泳中都能夠被分離開。核酸的

2、等電點偏酸，當處于電泳條件（PH=8）時，核酸鏈上帶有負電荷，在電場力的作用下會向正極泳動。電泳主要是指帶電顆粒在電場的作用下發(fā)生遷移的過程。許多重要的生物分子，如氨基酸、多肽、蛋白質、核苷酸、核酸等都具有可電離基團，它們在某個特定的pH值下可以帶正電或負電，在電場的作用下，這些帶電分子會向著與其所帶電荷極性相反的電極方向移動。1. DNA 的分子大小: 線狀雙鏈 DNA 分子在一定濃度瓊脂糖凝膠中的遷移速率與DNA 分子量對數(shù)成反比，分子越大則所受阻力越大，也越難于在凝膠孔隙中蠕行，因而遷移得越慢。影響因素2 DNA 分子的構象 相同分子量的線狀、開環(huán)和超螺旋DNA在瓊脂糖凝膠中移動速度是不

3、一樣的，超螺旋DNA移動最快。3 瓊脂糖濃度 一個給定大小的線狀 DNA 分子,其遷移速度在不同濃度的瓊脂糖凝膠中各不相同。DNA 電泳遷移率的對數(shù)與凝膠濃度成線性關系。凝膠濃度的選擇取決于DNA 分子的大小。凝膠濃度（%） 線性DNA長度（bp） 0.5 100030000 0.7 80012000 1.0 50010000 1.2 4007000 1.5 2003000 2.0 502000 對于瓊脂糖凝膠電泳，濃度通常在0.5-2%之間。低濃度膠可進行大片段核酸的分離，高濃度膠適合小片段核酸分析。分離小于0.5kb 的DNA片段所需膠濃度是1.2-1.5%,分離大于10kb 的DNA 分

4、子所需膠濃度為0.3-0.7%, DNA 片段大小間于兩者之間則所需膠濃度為0.8-1.0%。4 嵌入染料的存在 熒光染料溴化乙錠用于檢測瓊脂糖凝膠中的DNA，染料會嵌入到堆積的堿基對之間并拉長線狀和帶缺口的環(huán)狀DNA，使其剛性更強，還會使線狀DNA遷移率降低15。溴化乙錠（簡稱EB）是一種高度靈敏的熒光染色劑，經(jīng)紫外光透射儀激發(fā)可放射出橙紅色信號。由于溴化乙錠可以嵌入核酸堿基分子中，因此，核酸在瓊脂糖凝膠電泳時加入溴化乙錠染料，電泳后的凝膠放在紫外燈下觀察，就可以呈現(xiàn)出橙紅色的核酸條帶。GelRed是一種靈敏、穩(wěn)定和相對安全的熒光核酸染色試劑。它可以替代溴化乙錠，用于瓊脂糖凝膠或聚丙烯酰胺凝

5、膠中核酸的染色。熒光強度與DNA含量及大小成正比5電源電壓 在低電壓時，線狀DNA片段的遷移速率與所加電壓成正比。但是隨著電場強度的增加，不同分子量的DNA片段的遷移率將以不同的幅度增長，片段越大，因場強升高引起的遷移率升高幅度也越大，因此電壓增加，瓊脂糖凝膠的有效分離范圍將縮小。6 離子強度影響 電泳緩沖液的組成及其離子強度影響DNA的電泳遷移率。在沒有離子存在時(如誤用蒸餾水配制凝膠)，電導率最小，DNA 幾乎不移動，在高離子強度的緩沖液中(如誤加10電泳緩沖液)，則電導很高并明顯產(chǎn)熱，嚴重時會引起凝膠熔化或DNA變性。作用用于DNA檢測分析作為制備技術，在采用某些方法【如質譜(MS)、聚

6、合酶鏈式反應(PCR)、克隆技術、DNA測序或者免疫印跡】檢測之前，部分提純DNA分子.實驗儀器用品及試劑配制（1）用具及設備瓊脂糖凝膠電泳系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)Walter Schaffner發(fā)明的水平板凝膠成像系統(tǒng)（2）藥品及試劑配制TAE或TBE電泳緩沖液 TAE（Tris-乙酸緩沖液）：先配制50儲存液：242g Tris、57.1ml冰乙酸、100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）。使用時，將50儲存液稀釋至1的使用液（0.04mol/L Tris-乙酸、0.001mol/L EDTA）。DNA顯色劑Gelred顯色劑：10,000儲液6上樣緩沖液稱取40g蔗糖，加100ml雙

7、蒸水溶解，配制成40%蔗糖水溶液。稱取0.25g溴酚藍，加入到100ml 40%蔗糖水溶液中，混勻，于4保存。電泳指示劑溴酚蘭；二甲苯青作用：在電泳中形成肉眼可見的指示帶，可預測核酸電泳的速度和位置使樣品呈色，使加樣操作更方便膠濃度（%）溴酚藍二甲苯青0.61kb10.6kb2kb1.40.2kb1.6kb20.15kb實驗步驟2.配制1%瓊脂糖凝膠稱取0.8g瓊脂糖，置于250ml錐形瓶中，加入80ml 1TAE緩沖液，瓶口倒扣小燒杯。在微波爐中加熱煮沸至瓊脂糖全部融化，取出后搖勻。加熱過程中也要不時搖動錐形瓶，使附于瓶壁上的瓊脂糖顆粒進入溶液。當瓊脂糖溶液冷卻大約至5060（錐形瓶表面感覺

8、稍燙手但可忍受），加入溴化乙錠（EB）母液（10mg/ml），使其終濃度為0.5g/ml，或按照10ml加入1l Gelred 10,000儲液替代EB，迅速搖勻錐形瓶后，快速將瓊脂糖溶液倒入準備好的制膠裝置。瓊脂糖凝膠厚度在35mm。倒膠時要避免產(chǎn)生氣泡，若有氣泡可用吸管小心吸去。在室溫下放置約30分鐘，瓊脂糖溶液會凝固成凝膠狀態(tài)。小心拔去梳子。拔去梳子后，在凝膠中顯出一排加樣孔。將制膠架從多用制膠器中取出，放入電泳槽內的水平平臺上。在電泳槽中倒入與制膠相同的電泳緩沖液，緩沖液需要超過膠面0.5cm。1.準備制膠裝置 選擇并清洗合適規(guī)格的制膠架，將制膠架放入與其配套的多用制膠器中，將選擇好適

9、合的塑料梳子也插入多用制膠器上。3、制樣及點樣從冰箱中取出標準DNA、DNA樣品，溶化后進行制樣。將6上樣緩沖液與一定量的DNA樣品按照1ul：5ul比例于封口膜上混合，增加DNA樣品的密度?；蚪MDNA和質粒DNA樣品都吸取3ul與6上樣緩沖液混合， PCR產(chǎn)物吸取5ul與6上樣緩沖液混合。將混合后樣品使用微量移液器小心注入凝膠的加樣孔中。注入DNA樣品時，要將微量移液器吸頭的尖端略微伸入加樣孔中，但操作要小心，避免損壞凝膠或將加樣孔底部凝膠刺穿。每加完一個樣品，應更換一個微量移液器吸頭，以防樣品之間的污染。5.紫外觀察并分析電泳結果 戴上一次性手套，將凝膠從電泳槽中取出，盡可能將所有的電泳

10、緩沖液淋干。將凝膠放入凝膠成像系統(tǒng)的多功能樣品操作室中。打開紫外燈，通過凝膠成像系統(tǒng)操作軟件，觀察電泳結果。4.電泳 加完樣后，蓋上電泳槽蓋，將電泳槽的電線與電泳儀連接。將靠近加樣孔一處的電線與電泳儀負極連接，遠離加樣孔一處的電線與正極連接（注意正負極一定要連接正確），立即接通電源。 控制電壓保持在60-80V，電流在40mA以上。 當溴酚藍條帶移動到距離凝膠前沿約1-2cm時，停止電泳。凝膠凝固后取出梳子鋪膠加緩沖液電 泳點 樣 a b c d e 23.2kb 9.4kb 6.5kb 4.3kb 2.3kb 0.1kb 0.5kb 2.0kbDNA重組電泳示意圖a:基因組DNA；b:質粒DNA；c:質粒載體酶切后大片段；d：PCR產(chǎn)物；e：HindIII digest DNA marker注意事項1、 倒膠時把握好膠的溫度，不要高于60 ，否則溫度太高