電驅(qū)動與陽離子交換膜在脫氧核糖核酸捕獲濃縮中的應(yīng)用

1、電驅(qū)動與陽離子互換膜在脫氧核糖核酸捕捉濃縮中的應(yīng)用摘要】基于電驅(qū)動特性與離子互換膜的選擇透過性，構(gòu)建了新型、無損傷的脫氧核糖核酸dna捕捉濃縮裝置。以-dna為模子化合物，探究其在自組裝裝置中的富集特性，優(yōu)化了實行條件，對濃縮液舉行凝膠電泳實行以觀察dna是否變性，并舉行聚合酶鏈反響，以證實本要領(lǐng)接納的dna可供進(jìn)一步的生物闡發(fā)。效果表白：本裝置在低電壓條件下可以或許無損傷地捕捉dna，濃縮液可用于進(jìn)一步的生物闡發(fā)，dna的富集倍數(shù)達(dá)62倍，接納率達(dá)46%。本要領(lǐng)操縱輕便，制止利用大量有機試劑，微型化可與生物芯片聯(lián)用，在dna萃娶純化與濃縮范疇有較大的應(yīng)用空間。【關(guān)鍵詞】脫氧核糖核酸捕捉；電驅(qū)

2、動；離子互換膜；濃縮appliatinfeletrialdrivenandatiniexhangeebranetaptureandenrihdexyribnuleiaidhuanghua-bin，zhuangzhi-xia*，zhangen-hua，hujia，yangha-yng，angxia-ru(llegefheistryandheialengineering，xiaenuniversity，xiaen361005)(firsteangraphyinstitutefstateeaniadinistratin，peplesrepublifhina，qingda266061)(xiaenhu

3、axiavatinalllege，xiaen361024)abstratbasedntheseletivepereabilityfatiniexhangeebraneandtheharateristifeletrialdriven，aneandnn-daageapparatusthatanbeusedtseparatepundsithdifferenteletriprpertyasbuilttaptureandenrihdna.-dna，asadelpund，asusedtstudytheharateristifapturingandenrihingdnainthisdevie.fatrsth

4、atightaffettheeffiienysuhasvltageandflspeedereptiizedandgeleletrphresisasdnetstudyifdnaasdenaturatin，prasdnetprvethenentratinanbeusedtfurtherbianalysis.resultseregt：theapparatusuldusedtaptureandenrihdnasathelesslyunderthenditinfl-vltage，thenentrateultipleas62，andthereveryeffiienyasaessiblet47%，nentr

5、atinanbeusedfrthenextbianalysis.autati，easythandleandlittlerganireagentusingadeitbeadvantageus，ituldbeiniaturedtbineiththerbihips.thisethdhadalargeappliatinspaeinfieldfdnaextratin，purifiatinandnentratin.keyrdsdexyribnuleiaidapture；eletrialdriven；in-exhangeebrane；nentratin1弁言核酸的提取和純化在生物樣品的基因闡發(fā)實行中至關(guān)緊張

6、。傳統(tǒng)的提取要擁有酚-氯仿法，該要領(lǐng)裝備要求較低，但有機溶劑毒性強，耗時且難以主動化。別的的諸如超聲波法1，鹽熱法2，介電電泳法3等要領(lǐng)也由于各自的缺陷使其應(yīng)用受到限定。比年來，利用脫氧核糖核酸dna與二氧化硅微球的氫鍵作用吸附提取dna的技能成為研究熱門4，該要領(lǐng)落服了傳統(tǒng)要領(lǐng)溶劑毒性、耗時、難以主動化的缺點，但微球的制備、灌注與芯片封裝等步調(diào)的工藝技能要求較高47。如今，膜分散技能越來越受器重，應(yīng)用超濾和納濾膜的挑選特性對差異分子量的生物樣品舉行分散的要擁有許多報道8，而離子互換膜的應(yīng)用重要在脫鹽產(chǎn)業(yè)上，利用其截留特性舉行生物樣品尤其是生物大分子分散的應(yīng)用報道較少。本實行結(jié)合電場的定向驅(qū)動

7、特性和陽離子互換膜對負(fù)電性物質(zhì)的截留，構(gòu)建了一個無損傷的dna捕捉濃縮裝置，觀察了其富集特性，并優(yōu)化了實行條件。此要領(lǐng)在生物樣品的分散純化方面有較大的應(yīng)用空間。2實行部門2.1儀器和試劑hl-2恒流泵上海滬西闡發(fā)儀器廠；穩(wěn)壓直流電源(上海力友電氣公司)；perpabasi凝膠電泳儀bi-rad公司；nd-1000全波長紫外/可見光掃描分光光度計(ther公司)；凝膠成像體系kadak公司；pr儀bi-rad公司；鉑金電極，陽離子互換膜nafin1135，dupnt。-dna0.3gdna/l，bi；taqdna聚合酶prega；瓊脂糖lp0028a，英國xid公司；脫氧核糖核酸dntp，pre

8、ga公司；溴化乙錠sangn生物公司，別的試劑均為闡發(fā)純。超純水由illi-q制得r=18.2。陰極緩沖液：te緩沖液(10l/ltris-hl，1l/ledta-2na，ph8.0)；陽極緩沖液(1l/lkh2p4+3.5l/lk2hp4+1l/lna2s4，ph9.0)。-dna擴增片斷包羅101bp，正引物5-taagagaatagagaaga-3，反引物5-aagtttgaaaggtatt-3prega公司。2.2裝置與原理本淺易裝置綜合利用流路死體積，電驅(qū)動特點和離子互換膜的截留特性。如圖1，裝置重要部件由玻璃拉制而成，膜借助卡套結(jié)實，恒流泵所用管路和接口為硅膠管，別的管路為聚四氟乙

9、烯管，兩電極之間的間隔約5。dna緩沖體系借助恒流泵從1處流入，流經(jīng)捕捉界面支管口時，負(fù)電性的dna分子在電場中向陽極標(biāo)的目的遷徙而進(jìn)入豎直支管，到達(dá)陽離子互換膜時由于膜的截留特性，dna在膜四周聚集并制止了陽極的氧化作用。圖1dna捕捉濃縮裝置表示圖略fig.1generalskethfdevieusedtapturedna實行時，翻開止水夾，向此中注入緩沖液，使膜上地區(qū)布滿陰極緩沖液至支管口，確保支管中無氣泡，封閉止水夾。注入陽極緩沖液并布滿陽極地區(qū)，液面高于膜以確保膜四周無氣泡。翻開恒流泵，待液體流至陰極，開啟穩(wěn)壓電源。待溶液全部流過支管口，封閉穩(wěn)壓電源，翻開止水夾，網(wǎng)絡(luò)濃縮液150l。

10、實行竣事用陰極緩沖液洗濯管路。由于通電時間的延伸，陽極緩沖溶液中陽離子濃度低落，需實時更新。實行中，當(dāng)ph8.0時調(diào)換。膜利用前用陽極緩沖液浸泡。2.3實行要領(lǐng)3效果與討論3.1dna溶液濃縮效果濃縮前的稀釋液濃度為0.3g/l，低于nandrp的檢出限2g/l，而濃縮液在a260的汲取值為0.372，換算濃度為18.6g/l，a260/a280為1.70。可見，本裝置樂成地實現(xiàn)dna分子的濃縮。富集倍數(shù)到達(dá)62倍，接納率為47%。圖2為nandrp測定的稀釋液與濃縮液的汲取光譜。購置的dna的a260/a280為1.79，濃縮液的比值略微落落，推測其原由于濃縮歷程中緩沖體系中的陰離子向陽極地

11、區(qū)遷徙導(dǎo)致濃縮液的離子濃度較高，從而影響dna的檢測。圖2nandrp測定的稀釋液與濃縮液的汲取光譜略fig.2absrptinspetrafdiluentandnentratebynandrp3.2實行條件優(yōu)化3.3無損傷檢測為研究實行歷程中的dna是否產(chǎn)生斷裂，舉行了濃縮液的凝膠電泳實行。如圖3所示，1為te空缺，2為與濃縮液相近濃度的尺度dna的電泳條帶。3，4，5別離為事情電壓為400，250，150v時的濃縮液條帶，由圖中條帶2與4亮度相近且無雜帶可斷定濃縮歷程中的dna無斷裂產(chǎn)生；條帶4比5亮是由于4的dna濃度較高，而3無條帶，重要緣故原由是在較高電壓條件下，濃縮液中的陰離子濃度

12、增大，而高離子濃度溶液與高電壓條件下產(chǎn)生的熱效應(yīng)都易使得dna變性，詳細(xì)的變性機理另有待進(jìn)一步的研究。本實行通過調(diào)治事情電壓，實現(xiàn)了無損傷捕捉濃縮dna分子。為進(jìn)一步證實濃縮液可用于生物闡發(fā)，觀察了濃縮液的pr反響，產(chǎn)物的凝膠電泳如圖4。效果表白，濃縮液可樂成地擴增出目的片斷101bp，可見本實行的濃縮液可用于進(jìn)一步的生物闡發(fā)。圖3濃縮液的凝膠電泳圖譜略1.blank；2.-dna(19.0g/l)；3.nentrate(400v)；4.nentrate(250v)；5.nentrate(150v).圖4pr產(chǎn)物的凝膠電泳圖譜略fig.43%agarsegeleletrphresisfprpr

13、dutinfdna1.50bparker；2.blank(tebuffer)；3.-dna(19.0g/l)；4.nentrate(250v)4結(jié)論本實行樂成地實現(xiàn)了dna無損傷的捕捉濃縮，dna濃縮倍數(shù)62倍，富集服從50%，接納率約46%，濃縮液可用于進(jìn)一步的生物闡發(fā)。本要領(lǐng)較通例的要領(lǐng)操縱輕便主動，無須利用大量的有機試劑，進(jìn)一步微型化可與生物芯片聯(lián)用或集成于生物芯片，有望用于現(xiàn)實樣品中的dna的提取或純化。本裝置也可用于一樣平常無機離子或小分子極性有機物的預(yù)富集，低落痕量檢測時對儀器檢出限的要求【參考文獻(xiàn)】1akleyt，hakesjj，sbanskia，usins，spenglerj.ultrasnis，2000，38)：6386412belgraderp，benett，hadleyd，rihardsj，strattnp，ariellarj