人教版教學(xué)酶的生產(chǎn)條件的優(yōu)化以及常用酶的應(yīng)用市公開課獲獎?wù)n件

1、第二章 酶生產(chǎn) The production of Enzyme 1第1頁第1頁一、酶生產(chǎn)辦法 1、 提取法 (Extraction) 酶作為生物催化劑普遍存在于動物、植物、微生物中，能夠直接從生物體中分離提純而取得，早期酶生產(chǎn)多是以動植物為主要原料提取而得。 動、植物等原料中提取。例：胰臟胰蛋白酶、胰淀粉酶、胰脂肪酶； 動物胃胃蛋白酶； 動物小腸堿性磷酸酶； 木瓜木瓜蛋白酶； 菠蘿皮菠蘿蛋白酶； 檸檬酸發(fā)酵廢菌體果膠酶 等。第2頁第2頁利用動物、植物細(xì)胞和組織培養(yǎng)辦法來生產(chǎn)酶，由于周期較長、成本較高，也存在一定難度。50年代以來酶生產(chǎn)主要辦法。80年代以來，植物細(xì)胞或動物細(xì)胞發(fā)酵。主要方式：

2、固態(tài)發(fā)酵和液體發(fā)酵法2、發(fā)酵生產(chǎn)法 (Biosynthesis)第3頁第3頁1、氧化-還原酶（1）葡萄糖氧化酶（起源于霉菌）（2）D氨基酸氧化酶（起源于霉菌、腎臟）（3）尿激酶（起源于酵母菌、腎臟）（4）過氧化氫酶（起源于細(xì)菌、霉菌、紅血球）（5）近氧化物酶（起源于植物）2、轉(zhuǎn)移酶（1）轉(zhuǎn)氨基酶（起源于細(xì)菌、動物肝臟）（2）核苷磷酸轉(zhuǎn)移酶（起源于細(xì)菌）3、水解酶脂肪酶（起源于細(xì)菌、霉菌、胰臟）5-磷酸二酯酶（起源于霉菌）淀粉酶（起源于細(xì)菌、霉菌、胰臟、麥芽）果膠酶（起源于細(xì)菌、霉菌）纖維素酶（起源于霉菌、蘑菇）半纖維素酶（起源于霉菌）溶菌酶（起源于細(xì)菌、雞卵白）蜜二糖酶（起源于霉菌）乳糖酶（起

3、源于細(xì)菌、霉菌）轉(zhuǎn)化酶（起源于細(xì)菌、酵母）透明質(zhì)酸酶（起源于細(xì)菌、動物睪丸）凝乳酶（起源于霉菌、小牛胃、羊胃）天冬酰胺酶（起源于細(xì)菌）脲酶（起源于豆科植物）青霉素?；福ㄆ鹪从诩?xì)菌、霉菌）氨基酰化酶（起源于細(xì)菌、霉菌、牛腎臟）橙皮苷酶（起源于霉菌）蛋白酶（起源于霉菌、放線菌、動物內(nèi)臟、植物瓜果）第4頁第4頁4、裂合酶裂合酶天冬氨酸-脫羧酶（起源于細(xì)菌）-酪氨酸酶（起源于細(xì)菌）延胡索酸酶（起源于細(xì)菌）谷氨酸脫羧酶（起源于細(xì)菌）5、異構(gòu)酶氨基酸消旋酶（起源于細(xì)菌、霉菌、酵母）葡萄糖異構(gòu)酶（起源于細(xì)菌、放線菌第5頁第5頁（1）酶液體發(fā)酵生產(chǎn)普通過程液體酶制劑生產(chǎn)流程圖第6頁第6頁微生物種類多、酶種豐

4、富;微生物生長繁殖快，酶易提取;微生物培養(yǎng)基起源廣泛、價格廉價;酶發(fā)酵生產(chǎn)過程可實現(xiàn)規(guī)模化連續(xù)化。（2）微生物產(chǎn)酶長處第7頁第7頁3、化學(xué)合成法：60年代中期出現(xiàn)新技術(shù)。人工合成酶辦法 1969 年，美國初次用化學(xué)合成法得到含有124個氨基酸核糖核酸酶。要求氨基酸純度高，合成成本高昂。至今停留在試驗室階段。當(dāng)前還受到試劑、設(shè)備條件限制。第8頁第8頁1、中心法則（Central Dogma ）二、酶生物合成過程Reverse transcription第9頁第9頁2、RNA生物合成(轉(zhuǎn)錄)- Transcription 在RNA合成中，DNA二條鏈中僅有一條鏈可作為轉(zhuǎn)錄模板，稱為轉(zhuǎn)錄不對稱性。

5、轉(zhuǎn)錄所需酶 依賴DNARNA聚合酶又稱為轉(zhuǎn)錄酶。 原核生物轉(zhuǎn)錄酶由1種RNA聚合酶催化所有RNA生物合成。 真核生物中RNA聚合酶分別為RNA聚合酶、RNA聚合酶和RNA聚合酶3種，它們都屬于寡聚酶，酶亞基數(shù)目為410個，亞基種類有46種。第10頁第10頁過程：RNA聚合酶 DNA開啟基因，DNA雙螺旋部分解開，以其中一條鏈為模板，經(jīng)過堿基互補(bǔ)方式結(jié)合進(jìn)入第一個核苷酸，然后，RNA聚合酶移動，DNA逐步解開，按模板堿基次序逐一加入核苷酸并聚合成多聚核苷酸鏈。轉(zhuǎn)錄成RNA按結(jié)構(gòu)和功效不同分為mRNA,tRNA和rRNA。RNA聚合酶第11頁第11頁3、翻譯：以mRNA為模板，以氨基酸為底物，在核

6、糖體上通過各種tRNA，酶和輔助因子，合成多肽。分四個過程：A、氨基酸活化生成氨酰-tRNA B、肽鏈合成起始C、肽鏈延長D、肽鏈合成終止第12頁第12頁A、氨基酸活化生成氨酰-tRNA氨基酸在氨酰-tRNA合成酶作用下，與特定tRNA結(jié)合，由ATP供應(yīng)能量；第13頁第13頁AAULeucineACUAsparticAcidAUGThreonineTRANSFER RNAAMINO ACIDS第14頁第14頁AAULeucineACUAsparticAcidAUGThreonineAmino acids combine with the tRNAs using the energy from

7、the splitting of ADP.第15頁第15頁AAULeucineACUAsparticAcidAUGThreonineAmino acids combine with the tRNAs using the energy from the splitting of ADP.第16頁第16頁AAULeucineACUAsparticAcidAUGThreonineANTICODON第17頁第17頁B、肽鏈合成起始：在GTP和起始因子參與下核糖體30S亞基、甲酰甲硫氨酰-tRNAF（fMet-tRNAF）、mRNA 和 50S亞基結(jié)合構(gòu)成起始復(fù)合物。第18頁第18頁30S與起始因子I

8、F3結(jié)合；30S與mRNA結(jié)合形成30S- IF3-mRNA復(fù)合物；fMet-tRNAF與起始因子IF2以及GTP結(jié)合；過程可分為五個階段進(jìn)行：第19頁第19頁在起始因子IF1參與下，fMet-tRNAF -IF2-GTP與30S- IF3-mRNA結(jié)合生成30S起始復(fù)合物，fMet-tRNAF正好位于mRNA起始密碼子AUG上；第20頁第20頁50S與30 S起始復(fù)合物結(jié)合，形成含有完整結(jié)構(gòu)70S 核糖體。同時放出IF1 、IF2 、IF3并使GTP水解生成GDP和Pi； 第21頁第21頁C、肽鏈延長：在延伸因子參與下，與mRNA上密碼子相應(yīng)氨酰-tRNA進(jìn)入70S核糖體之中“A”位。 第2

9、2頁第22頁通過肽合成酶作用，P位上fMet-tRNAF甲酰甲硫氨酰(fMet)與A位上氨酰-tRNA(aa1-tRNA：)以肽鍵結(jié)合，形成肽酰-tRNA。 第23頁第23頁mRNA和核糖體作相對移動，A位上肽酰t-RNA轉(zhuǎn)至P位，而原在P位上t-RNAF游離出去。然后下一個氨酰-tRNA進(jìn)入A位，再重復(fù)上述過程，使肽鏈不斷延伸，直至終止密碼子為止。 第24頁第24頁D、 肽鏈合成終止：伴隨肽鏈延伸，mRNA與70s核糖體不斷地作相對移動。當(dāng)mRNA分子中終止密碼子(UAA，UAG，UGA)移動到核糖體A位時，沒有相應(yīng)氨酰-tRNA進(jìn)入，此時釋放因子(Release Factor)進(jìn)入A位，并

10、與終止密碼子結(jié)合。第25頁第25頁新合成肽鏈釋放出來需通過加工形成完整空間結(jié)構(gòu)酶或蛋白質(zhì)。先通過肽脫甲酰酶作用，使甲酰甲硫氨酸殘基上甲?；?。有時還需在氨肽酶作用下從肽鏈N-末端切除一個或數(shù)個氨基酸殘基。然后自動折迭彎曲成完整空間結(jié)構(gòu)。第26頁第26頁三、酶生物合成調(diào)整 雅各布(Jacob)和莫諾德(Monod)于1960年提出操縱子學(xué)說來闡明酶生物合成調(diào)整。操縱子調(diào)整基因Regulator gene啟動基因Promoter gene操縱基因Operator gene結(jié)構(gòu)基因Strutural gene第27頁第27頁（1）基因調(diào)控模式3種調(diào)控模式：分解代謝物阻遏作用；酶合成誘導(dǎo)作用；酶合成

11、反饋?zhàn)瓒糇饔谩?第28頁第28頁 1 ）分解代謝物阻遏作用易利營養(yǎng)基質(zhì)代謝使細(xì)胞內(nèi)ATP濃度增長，從而使AMP濃度減少。cAMP可通過磷酸二酯酶水解成AMP致使cAMP濃度之而減少。cAMP-CRP復(fù)合物濃度跟著減少。結(jié)果，在啟動基因(P)上沒有cAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合，RNA聚合酶也就無法結(jié)合到啟動基因位點(diǎn)上。結(jié)構(gòu)基因(S)上遺傳信息無法轉(zhuǎn)錄，酶合成無法進(jìn)行。第29頁第29頁當(dāng)易利用基質(zhì)不存在或用完后，伴隨細(xì)胞中ATP濃度下降，而使ADP，AMP，cAMP濃度增長。當(dāng)cAMP-CRP濃度增長到一定量時候，cAMP-CRP復(fù)合物結(jié)合到啟動基因特定位點(diǎn)上，RNA聚合酶也伴隨結(jié)合到它位點(diǎn)上，酶生

12、物合成就有也許進(jìn)行。第30頁第30頁2）酶生物合成誘導(dǎo)作用無誘導(dǎo)物時，阻抑蛋白與操縱基因結(jié)合較強(qiáng)，啟動基因上RNA 聚合酶無法進(jìn)入結(jié)構(gòu)基因上轉(zhuǎn)錄，酶不能合成。有誘導(dǎo)物時，誘導(dǎo)物與阻抑蛋白結(jié)合，阻抑蛋白結(jié)構(gòu)改變，不能與操縱基因結(jié)合，RNA聚合酶可進(jìn)行轉(zhuǎn)錄生成mRNA，再進(jìn)一步翻譯成酶蛋白多肽鏈。第31頁第31頁3）酶生物合成反饋?zhàn)瓒糇饔卯?dāng)沒有共阻遏物（酶催化產(chǎn)物或路徑末端產(chǎn)物）時，阻抑蛋白不能與操縱基因結(jié)合，啟動基因上RNA聚合酶能順利通過操縱基因位置，結(jié)構(gòu)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而合成酶蛋白多肽鏈。 當(dāng)有共阻遏物時與阻抑蛋白特異結(jié)合形成完全阻遏物，與操縱基因親和力增強(qiáng)，制止RNA聚合酶通過，結(jié)構(gòu)基因無

13、法轉(zhuǎn)錄，酶合成受阻。第32頁第32頁四、酶生物合成模式細(xì)胞生長過程：調(diào)整期、生長期、平衡期和衰退期等4個階段比較細(xì)胞生長與酶產(chǎn)生關(guān)系, 酶生物合成模式分為：同時合成型、延續(xù)合成型、中期合成型和滯后合成型。 第33頁第33頁1、同時合成型 酶生物合成與細(xì)胞生長同時進(jìn)行。酶合成速度與細(xì)胞生長速度緊密聯(lián)系，又稱為生長偶聯(lián)型。屬于該合成型酶，細(xì)胞進(jìn)入旺盛生長期時，酶大量生成；當(dāng)細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶合成伴隨停止。 細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml總細(xì)胞濃度 活細(xì)胞濃度胞外酶濃度 胞內(nèi)酶濃度大部分構(gòu)成酶生物合成屬于同時合成型，有部分誘導(dǎo)酶也按照此種模式進(jìn)行生物合成。 比如米曲霉在含有單寧或者沒食子酸培

14、養(yǎng)基中生長，在單寧或沒食子酸誘導(dǎo)作用下，合成單寧酶（tanase EC3.1.1.20）。 第34頁第34頁2、延續(xù)合成型 酶生物合成在細(xì)胞生長階段開始，在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后，酶還能夠延續(xù)合成一段較長時間。 屬于該類型酶能夠是構(gòu)成酶，也能夠是誘導(dǎo)酶。比如， 在黑曲霉在以半乳糖醛酸或果膠為單一碳源培養(yǎng)基中培養(yǎng)，能夠誘導(dǎo)聚半乳糖醛酸酶（Polygalacturonase，EC3.2.1.15）生物合成。 細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml以半乳糖醛酸為誘導(dǎo)物 以含有葡萄糖果膠為誘導(dǎo)物 第35頁第35頁3、中期合成型 該類型酶在細(xì)胞生長一段時間以后才開始，而在細(xì)胞生長

15、進(jìn)入平衡期以后，酶生物合成也伴隨停止。 細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml比如，枯草桿菌堿性磷酸酶（Alkaline phophatase，EC 3.1.3.1)生物合成模式屬于中期合成型。由于該酶合成受到其反應(yīng)產(chǎn)物無機(jī)磷酸反饋?zhàn)瓒?，而磷又是?xì)胞生長所必不可缺營養(yǎng)物質(zhì)，培養(yǎng)基中必須有磷存在。在細(xì)胞生長開始階段, 培養(yǎng)基中磷阻遏堿性磷酸酶合成，只有當(dāng)細(xì)胞生長一段時間， 培養(yǎng)基中磷幾乎被細(xì)胞用完（低于0.01 mmol/L）以后，該酶才開始大量生成。又由于堿性磷酸酶所相應(yīng)mRNA不穩(wěn)定，其壽命只有30 min左右，因此當(dāng)細(xì)胞進(jìn)入平衡期后， 酶生物合成伴隨停止。第36頁第36頁4、滯后合成型 這類型酶

16、是在細(xì)胞生長一段時間或者進(jìn)入平衡期以后才開始其生物合成并大量積累。又稱為非生長偶聯(lián)型。許多水解酶生物合成都屬于這一類型。酶合成受到培養(yǎng)基中存在阻遏物阻遏作用。只有伴隨細(xì)胞生長，阻遏物幾乎被細(xì)胞用完而使阻遏解除后，酶才開始大量合成。 若培養(yǎng)基中不存在阻遏物，該酶合成能夠轉(zhuǎn)為延續(xù)合成型。該類型酶所相應(yīng)mRNA穩(wěn)定性較好，能夠在細(xì)胞生長進(jìn)入平衡期后相稱長一段時間內(nèi)，繼續(xù)進(jìn)行酶生物合成。黑曲霉羧基蛋白酶生物合成 放線菌素D 對產(chǎn)酶影響細(xì)胞濃度mg/ml酶濃度U/ml酶濃度U/ml酶濃度U/ml3022不加加入不加加入第37頁第37頁5、抱負(fù)酶合成模式mRNA穩(wěn)定性好，平衡期以后繼續(xù)合成酶；不受阻遏物影

17、響；生產(chǎn)中，最抱負(fù)合成模式應(yīng)是延續(xù)合成型。同時合成型要盡也許提升其對應(yīng)mRNA穩(wěn)定性，為此適當(dāng)降低發(fā)酵溫度是可取辦法；滯后合成型要設(shè)法降低培養(yǎng)基中阻遏物濃度 ，盡也許降低甚至解除產(chǎn)物阻遏或分解代謝物阻遏作用，使酶生物合成提早開始；中期合成型則要在提升mRNA穩(wěn)定性以及解除阻遏兩方面下功夫，使其生物合成開始時間提前， 并盡也許延遲其生物合成停止時間。第38頁第38頁6、酶生產(chǎn)過程中細(xì)胞生長動力學(xué) 細(xì)胞生長動力學(xué)主要研究細(xì)胞生長速度以及外界環(huán)境原因?qū)?xì)胞生長速度影響規(guī)律。1950年，法國 Monod首先提出了表述微生物細(xì)胞生長動力學(xué)方程。 在培養(yǎng)過程中， 細(xì)胞生長速率與細(xì)胞濃度成正比 。假設(shè)培養(yǎng)基

18、中只有一個限制性基質(zhì)，而不存在其它生長限制原因時，為這種限制性基質(zhì)濃度函數(shù)。KS 為Monod常數(shù)， 是指比生長速率達(dá)到最大比生長速率二分之一時限制性基質(zhì)濃度。第39頁第39頁限制性基質(zhì)物料平衡式連續(xù)培養(yǎng)時方程改變形式第40頁第40頁7、酶生產(chǎn)過程中產(chǎn)酶動力學(xué) 第41頁第41頁與生長相關(guān)與生長部分相關(guān)與生長無關(guān)第42頁第42頁慣用幾種模型第43頁第43頁五、酶生產(chǎn)菌種枯草桿菌：淀粉酶、蛋白酶；巨大芽孢桿菌：葡萄糖異構(gòu)酶；大腸桿菌：谷氨酸脫羧酶、青霉素酰化酶等。啤酒酵母：轉(zhuǎn)化酶、醇脫氫酶；假絲酵母：脂肪酶、轉(zhuǎn)化酶；黑曲酶：果膠酶、酸性蛋白酶、糖化酶；根霉：糖化酶、轉(zhuǎn)化酶；毛霉菌：蛋白酶、糖化酶、

19、脂肪酶；青霉：纖維素酶、葡萄糖氧化酶；米曲霉：糖化酶、蛋白酶；鏈霉菌：青霉素?；?、堿性蛋白酶、幾丁質(zhì)酶。 第44頁第44頁六、酶發(fā)酵生產(chǎn)工藝過程1、種子擴(kuò)大培養(yǎng)目的：為每次發(fā)酵罐投料提供一定數(shù)量代謝旺盛菌種。 種子擴(kuò)大培養(yǎng)級數(shù)分為多級流程（普通三級）：斜面菌種搖床一級種子培養(yǎng)-二級種子罐培養(yǎng)-發(fā)酵罐第45頁第45頁2、發(fā)酵辦法（1）固體發(fā)酵法：第46頁第46頁（2）液體發(fā)酵法：第47頁第47頁（3）固定化細(xì)胞（4）固定化原生質(zhì)體第48頁第48頁3、發(fā)酵工藝條件控制（液體發(fā)酵為例）（1）pH值調(diào)整細(xì)胞產(chǎn)酶最適pH通?？拷谠撁阜磻?yīng)最適pH。如：堿性蛋白酶最適pH為pH8.5-9.0；中性蛋白酶

20、最適pH為pH6.0-7.0；酸性蛋白酶最適pH為pH4-6；不同細(xì)胞需不同pH值;同一細(xì)胞不同pH值條件下產(chǎn)物也不同.黑曲霉中性時產(chǎn)-淀粉酶多于產(chǎn)糖化酶，偏酸時產(chǎn)糖化酶提升而產(chǎn)淀粉酶降低。第49頁第49頁（2）溫度調(diào)整：產(chǎn)酶速度：分段控溫。產(chǎn)熱原因：生物熱+攪拌熱-蒸發(fā)熱-顯熱-輻射熱控制：冷卻（3）溶解氧調(diào)整N=KLC（C*-C）影響：菌體生長；代謝路徑原因：菌體生長代謝；發(fā)酵異常（染菌：好氧雜菌、噬菌體；設(shè)備故障：加油器失靈、攪拌停止、溫控失靈、空氣管堵塞）控制：供氧角度（罐結(jié)構(gòu)L/D、攪拌、氣體成份、通氣速率、罐壓）；耗氧角度（基質(zhì)濃度、溫度、表面活性劑）。第50頁第50頁4、提升酶產(chǎn)

21、量辦法（1）添加誘導(dǎo)物：酶作用底物、酶反應(yīng)產(chǎn)物、酶底物類似物。（2）控制阻遏物濃度：流加難利用碳源；減少未端產(chǎn)物濃度。（3）添加表面活性劑：非離子表面活性劑（吐溫等）可增長細(xì)胞通透性。（4）添加產(chǎn)酶增進(jìn)劑：植酸鈣鎂霉菌蛋白酶；PVA糖化酶；醋酸鈉纖維素酶第51頁第51頁1、激肽釋放酶（1）藥理功效-含有擴(kuò)張血管功效，并能提升血管通透性，起到改進(jìn)血液循環(huán)作用。（2）臨床應(yīng)用-治療動脈硬化、血管炎、四肢皮膚潰瘍。（3）生產(chǎn)辦法 提取法生產(chǎn)-以豬頷下腺為原料進(jìn)行提取。 提取法生產(chǎn)-以豬胰臟為原料進(jìn)行提取。七、常見藥用酶生產(chǎn)第52頁第52頁2、雙鏈酶（1）藥理作用-內(nèi)含二種酶，兩者合用可清除炎癥物、膿塊、瘀血，增進(jìn)外傷傷愈合。 鏈激酶（SK）、又稱為溶栓酶。能溶解血栓和滲出物纖維部分。鏈道酶（SD）、又稱為脫氧核糖核酸酶。能夠液化死細(xì)胞（2）臨床應(yīng)用-治療血腫、膿腫、骨髓炎、創(chuàng)傷性感染、潰瘍。（3）生產(chǎn)辦法-細(xì)菌發(fā)酵法生產(chǎn)。第53頁第53頁3、超氧化物歧化酶（1）藥理作用-能專一性地清除人體內(nèi)超氧陰離子自由基。（2）臨床應(yīng)用-治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎，本身