卵巢癌患者exosomes來源初探

1、卵巢癌患者exosomes來源初探李奇靈孫陽珍于月成方靜張媛麗辛?xí)匝唷娟P(guān)鍵詞】exses；腹水；卵巢腫瘤；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)parisnfextratinethdsfexsesfrpatientsithvariananer【Abstrat】AI:Tparetheextratinethdsfexsesfrtissuerasitesfanadvanedvariananerpatient,tdetettheexpressinfexsesftsure,andtexplrethebestpathayfaquiringexses.ETHDS:Thetissuefvariananerastakenandthean

2、erellsereseparatedandultured.Theellulturesupernatantaslleted.Theasitesaslletedfrthesaepatient.Theexsesereextratedbyultraentrifugatinandultrafiltratinfrtheellulturesupernatantandtheasitesandereexainedundereletrnirspe.HSP70,HSP90,HlassleuleandHlassleulenexseseretestedbyesternbltting.TheprtEinnentratin

3、fexsesastestedbyBAethd.RESULTS:Thetiefrtheentrifugatinfasitesaslngerthanthatfsupernatant.Theexsesuldbebtainedfrallfthesupernatantsandtheasitesithanerells,ntfrtheasitesithutanerells.TheexsesexpressedHlassleule,HSP70andHSP90exeptHlassleule.Theprteinnentratinfexsesintheasitesashigherthanthatfthesuperna

4、ntantfellulture(P0.05).NLUSIN:Asitesisabettersurefexsesfrthevariananerpatientithalignanteffusinithpsitiveanerells.Theexsesanbeextratedfrvariananertissuefrthepatientsithutasitesrithasitesinhihanerellsarenegative.【Keyrds】exses;asites;varianneplass;ellulturetehniques【摘要】目的：同一晚期卵巢癌患者，對組織來源和腹水來源的exses進(jìn)展方

5、法和數(shù)量的比擬，討論獲得卵巢癌患者exses的最正確途徑.方法：搜集晚期卵巢癌患者卵巢癌組織，別離癌細(xì)胞進(jìn)展培養(yǎng)，留上清液，取同一患者的腹水，通過超速離心和超濾等方法提取上清液及腹水中的exses,電鏡下檢測；esternBlt測定exses上HSP70,HSP90,H類分子和H類分子的表達(dá)；用BA蛋白測定法測定exses的蛋白濃度,計(jì)算蛋白總含量.結(jié)果：腹水離心時(shí)間比上清液離心時(shí)間長，所有細(xì)胞培養(yǎng)上清液和癌細(xì)胞陽性的腹水均能別離出exses，癌細(xì)胞陰性的腹水中未別離出exses；兩種來源的exses共同表達(dá)H類分子、HSP70和HSP90，均不表達(dá)H類分子，腹水中別離出來的exses蛋白含量

6、比細(xì)胞培養(yǎng)上清液的含量高P0.05.結(jié)論：腹水中癌細(xì)胞陽性的患者，腹水是exses的比擬理想的來源；無腹水或腹水中癌細(xì)胞陰性的患者，exses可來源于卵巢癌組織.【關(guān)鍵詞】exses；腹水；卵巢腫瘤；細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)0引言exses是許多種細(xì)胞都能分泌的直徑3090n的小囊泡，由蛋白質(zhì)和脂質(zhì)組成的亞細(xì)胞器.近年來，癌癥患者的腫瘤細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞dendritiell,D分泌的exses，由于它攜帶所分泌細(xì)胞的一些抗原信息，被作為腫瘤特異性抗原的來源，用于惡性腫瘤免疫治療1-2的研究.由D分泌的exses已經(jīng)在黑色素瘤和非小細(xì)胞肺癌進(jìn)入了臨床期試驗(yàn)3,但exses在卵巢癌中的研究進(jìn)展較慢.本研究我們

7、對晚期卵巢癌患者組織來源和腹水來源的exses別離方法、獲得量比擬，討論卵巢癌患者最正確exses來源途徑.1對象和方法1.1對象選擇202201/202212在西安交通大學(xué)第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科住院的原發(fā)性卵巢癌患者15例，年齡536歲.臨床分期期，均伴有腹水，腹水中查出癌細(xì)胞者10例(10/15)，腹水中癌細(xì)胞陰性者5例(5/15).取標(biāo)本前未經(jīng)化療，均為第一次剖腹探查，術(shù)中無菌操作留取卵巢癌組織，術(shù)前或術(shù)中留取腹水.術(shù)后病理診斷，漿液性囊腺癌9例，黏液性囊腺癌6例.99.93%重水購自Siga公司；RPI1640培養(yǎng)液購自Gib公司；entriplus離心超濾管100KDa、AinUltra

8、高回收率高流速切向流超濾離心管100KDa購自美國illipre公司；兔抗人熱休克蛋白HSP70多克隆抗體、兔抗人HSP90多克隆抗體購自武漢博士德生物工程公司；鼠抗人H類分子(HLAAB)Ab、鼠抗人H類分子HLADRAb購自華美公司；esternBlt試劑盒包括酶標(biāo)記二抗、A液和B液購自Piere公司，BA蛋白濃度測定試劑盒，購自碧云天生物技術(shù)研究所.1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)采用機(jī)械分散法獲得腫瘤細(xì)胞懸液：將腫瘤組織剪成5103的小塊組織，棄去結(jié)締組織、壞死組織、血管等.輕輕擠壓腫瘤組織過100目的篩網(wǎng)，懸液再過200目篩網(wǎng)，將所得的細(xì)胞懸液置于含2l/LL谷氨酰胺和青霉素1105U/

9、L、鏈霉素100g/L的無血清RPI1640全培養(yǎng)液中，于37含50L/L2細(xì)胞培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)，隔日傳代,待細(xì)胞生長至對數(shù)期時(shí)，搜集上清液.用25g/L胰酶消化搜集細(xì)胞，用PBS洗滌重懸，調(diào)整細(xì)胞濃度為11010/L.實(shí)驗(yàn)均用對數(shù)生長期的細(xì)胞.1.2.2exses的獲得分別取腹水和細(xì)胞培養(yǎng)上清液，以300g離心5in，取上清液；以800g離心30in，去沉淀；再以10000g離心40in，取上清液；參加entriplus超濾離心管中，以1500g離心1h，取濃縮液.將30g/L的蔗糖/重水墊、濃縮液和10l/LPBS依次放入離心管中，低溫下以100000g超速離心1h.取出混有exses的蔗

10、糖/重水墊,10l/LPBS懸浮，參加AinUltra高回收率高流速切向流超濾離心管中,以1500g離心30in，重復(fù)3次.取濃縮液用10l/LPBS懸浮成5L，為待測液.記錄離心和超濾次數(shù)，置于4冰箱中保存?zhèn)溆?1.2.3exses的鑒定1.2.3.1電鏡將待測液各取20L滴于載樣銅網(wǎng)上，于室溫靜置1in；用濾紙從側(cè)面吸干液體，滴加20g/L磷鎢酸pH6.8約30L于銅網(wǎng)上，室溫負(fù)染1in；用濾紙吸干負(fù)染液，在白熾燈下烤干后，于透射電鏡下觀察，并照相.1.2.3.2esternBlt方法灌制SDSPAGE電泳膠6%濃縮膠，12%別離膠；用細(xì)胞培養(yǎng)上清液中exses陽性的待測液、腹水中exse

11、s陽性的待測液、癌細(xì)胞裂解液和腹水中exses陰性的待測液各15L，上樣于四塊PAGE凝膠的對稱位置，恒壓100V電泳，至溴芬藍(lán)帶泳至膠底以上約1處，終止電泳；用電轉(zhuǎn)移裝置將蛋白轉(zhuǎn)至N膜上；電泳轉(zhuǎn)移完畢后，取出膜，用TBS洗滌1次；將膜放入封閉液，室溫下封閉1h，或4封閉過夜；用封閉液稀釋各抗體上清HSP70150；HSP90150；H1100；H1100，與含有目的蛋白條帶的膜在室溫下作用1h；TBST洗膜4次，每次15in；按試劑盒說明稀釋酶HRP標(biāo)記二抗，與膜室溫下作用30in；TBST洗膜4次，每次15in；按試劑盒說明混合A液和B液，與膜作用1in后進(jìn)展X光片曝光；顯影和定影后觀察結(jié)

12、果.1.2.4exses濃度測定取腹水和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中exses陽性的待測液，用BA蛋白濃度測定試劑盒分別測定的蛋白濃度，步驟如下：按50體積BA試劑A加1體積BA試劑B501配制適量BA工作液，充分混勻.完全溶解蛋白標(biāo)準(zhǔn)品，取10L用PBS稀釋至100L，使終濃度為0.5g/L.將標(biāo)準(zhǔn)品按0,1,2,4,8,12,16,20L加到96孔板的標(biāo)準(zhǔn)品孔中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液補(bǔ)足到20L.加10L樣品到96孔板的樣品空中，加標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液到20L.各孔參加200LBA工作液，37放置30in.測定A562n值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算出蛋白濃度.統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS10.0統(tǒng)計(jì)軟件包分析,兩組之

13、間均數(shù)比擬采用t檢驗(yàn),P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義.2結(jié)果2.1離心及超濾過程的比擬腹水標(biāo)本與細(xì)胞培養(yǎng)上清液標(biāo)本離心次數(shù)一樣，而超濾次數(shù)多于細(xì)胞培養(yǎng)上清液，腹水標(biāo)本超濾慢，時(shí)間長，100L標(biāo)本需要(709)in，易堵塞超濾管的超濾孔；而細(xì)胞培養(yǎng)上清液那么需要(207)in，兩者相比有顯著性差異(P0.05),相對腹水標(biāo)本而言，從細(xì)胞培養(yǎng)上清液中別離exses可節(jié)省時(shí)間和超濾管.2.2電鏡分別將兩種標(biāo)本置于透射電子顯微鏡下觀察，可見具有明顯異質(zhì)性的圓形或橢圓形小囊泡，直徑約3090n，有完好的包膜，內(nèi)為低電子密度物質(zhì)圖1.10例晚期卵巢癌患者癌細(xì)胞陽性腹水標(biāo)本和15例細(xì)胞培養(yǎng)上清液中，均能別離出

14、exses,電鏡下形態(tài)無區(qū)別.5例晚期卵巢癌患者癌細(xì)胞陰性腹水標(biāo)本中未別離出exses.圖1電鏡下人晚期卵巢癌患者來源的exses略2.3免疫蛋白的表達(dá)在細(xì)胞培養(yǎng)上清e(cuò)xses陽性待測液、腹水中exses陽性的待測液、癌細(xì)胞裂解液標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)大約在r(103)為90，35和73處有一明顯的特異蛋白帶，通過esternBlt檢測后，該蛋白帶可被HSP90,H類分子抗體和HSP70抗體特異性識別圖2，從而肯定其為HSP90,H類分子和HSP70基因的蛋白表達(dá)產(chǎn)物.在r(103)為40處無蛋白帶表達(dá)，故無H類分子表達(dá).腹水中exses陰性的待測液中無蛋白表達(dá).圖2HSP70,HSP90和H類分子的es

15、ternBlt表達(dá)情況略2.4腹水及細(xì)胞培養(yǎng)上清液中別離exses的各種參數(shù)表1和表2蛋白總量(g)=最終體積LBA法測的蛋白濃度(g/L).腹水來源標(biāo)本：平均每個(gè)患者的exses蛋白總量為3.271.44g.組織來源標(biāo)本的exses蛋白總量為0.770.40g，與腹水來源標(biāo)本蛋白含量3.271.44g相比，P=0.00,P0.01，有顯著性差異.表1晚期卵巢癌10例患者癌細(xì)胞陽性的腹水中別離的exses參數(shù)略表2晚期卵巢癌15例患者組織來源的exses參數(shù)略3討論經(jīng)研究證實(shí)exses來源于細(xì)胞內(nèi)的多囊體,多囊體內(nèi)的富含肽段H分子的小泡被釋放到細(xì)胞間隙中，形成所謂的exses.在鼠實(shí)驗(yàn)中，D來

16、源的exses顯示了具有免疫原性的特征，可以消除腫瘤,說明exses是具有生物活性的囊泡，具有免疫調(diào)節(jié)作用和潛在的抗腫瘤作用4.面向臨床應(yīng)用的GP級外來體的制備和純化程序,即通過一系列標(biāo)準(zhǔn)離心和超濾的方法別離exses,用電鏡鑒定其形態(tài)和直徑，esternBlt或免疫電鏡方法證明其上表達(dá)細(xì)胞膜成分，目前已用于腫瘤免疫治療，其來源包括腫瘤細(xì)胞來源，D來源以及惡性漿液5-7.本研究我們利用標(biāo)準(zhǔn)方法制備exses，從10例癌細(xì)胞陽性的卵巢癌患者腹水和15例組織來源的細(xì)胞培養(yǎng)上清液中別離出了exses，用電鏡證實(shí)了其形態(tài).我們發(fā)現(xiàn)對同一卵巢癌患者腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清液和腹水來源的exses進(jìn)展了比擬，發(fā)現(xiàn)

17、從細(xì)胞培養(yǎng)上清液和腹水中別離的exses與腹水中的癌細(xì)胞裂解液表達(dá)一樣的免疫原性蛋白分子HSP70、HSP90和H類分子，這些與腫瘤親密相關(guān)的分子說明腹水和細(xì)胞培養(yǎng)上清液中exses均來源于卵巢癌細(xì)胞.有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤來源的exses除了含有攜帶高濃度的腫瘤抗原候選分子、抗原提呈分子及其伴侶分子外，還含有四次跨膜蛋白，GPI錨定蛋白等8.Bard等9從4例間皮瘤、2例肺癌、2例乳腺癌和1例卵巢癌的胸水中別離出外來體，其上包含有特異性抗原：SNX25,BTG,PEDF,thrbspndin2.卵巢癌患者的腹水來源的exses所攜帶的抗原信息可能也是很豐富的，需要進(jìn)一步證實(shí).每次抽腹水可獲得9

18、302100L，其內(nèi)含有exses蛋白總量為3.271.44g，而經(jīng)過10余次的細(xì)胞培養(yǎng)傳代，可獲得細(xì)胞培養(yǎng)上清液100L,獲得exses的蛋白總量為0.770.40g，明顯少于腹水來源的exses.所以對于腹水中癌細(xì)胞陽性的患者而言,腹水是exses的理想來源，不但量豐富，而且采集方法簡單、痛苦小，可直接別離.相對于體外培養(yǎng)細(xì)胞上清而言，腹水來源的exses具有幾個(gè)優(yōu)勢：可以大量制備，免除了繁瑣的細(xì)胞培養(yǎng).電鏡結(jié)果證實(shí)腹水中含有大量的大小不一的exses.exses上的HSP70,HSP90和H類分子為相關(guān)性最親密的腫瘤抗原，這些是被自身抗原呈遞細(xì)胞攝取和呈遞的關(guān)鍵分子.exses表達(dá)HSP

19、70,HSP90和H類分子，這些根源性腫瘤抗原說明這些exses是來自于腫瘤細(xì)胞.Andre等用抗H類分子ABAb進(jìn)展的免疫吸附試驗(yàn)證實(shí)每毫升惡性積液中平均含有81010個(gè)exses性H分子，而體外培養(yǎng)的腫瘤細(xì)胞上清約為每毫升7109個(gè)exses性H分子.所有這些數(shù)據(jù)說明惡性積液是腫瘤細(xì)胞源性exses的豐富來源，而且其上的腫瘤抗原/H復(fù)合物非常合適臨床應(yīng)用.本研究雖然發(fā)現(xiàn)對于同一卵巢癌患者來說，在別離方法和獲得量上比擬，從癌細(xì)胞陽性的腹水中獲得exses比細(xì)胞培養(yǎng)理想，但哪一種來源的exses在免疫治療中會發(fā)揮更大的作用需進(jìn)一步研究.【參考文獻(xiàn)】1DelayreA,EstellesA,SperindeJ,etal.Exsedisplaytehnlgy:AppliatinstthedevelpentfnediagnstisandtherapeutisJ.BldellslDis,2022,35(2):158-168.2牟丹蕾，賈戰(zhàn)生，白雪帆.胞體外免疫治療中的“特洛伊木馬