生物選修一(考點)資料

1、秦淮中學2015 秦淮中學2015 屆高三生物一輪復習 分離純化大腸桿菌的接種方法：劃線平板法和稀釋涂布平板法。接種后的培養(yǎng)基的培養(yǎng)： 置于 恒溫箱 中 37 培養(yǎng)1 2d。挑取大腸桿菌菌落 多次進行接種培養(yǎng)可以純化 大腸桿菌菌種。 20保存 ）菌種 保存方法 ： 20保存 ）（二）土壤中分解尿素的微生物的分離與計數(shù)：篩選原理及方法：（ 1）原理：尿素分解菌能合成 脲酶 ，能利用脲酶分解尿素 ，因此 可以尿素為氮源（ 2）篩選方法： 用 以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)土壤微生物進行篩選。實驗方法步驟：本實驗采用稀釋涂布平板法和 活菌計數(shù)法。（ 1）土壤取樣：從肥沃、濕潤的土壤中取樣。先鏟去表層土

2、3cm 左右，再取樣，將樣品裝入事先準備好的信封中 ?！?注意 】取土樣用的小鐵鏟和盛土樣的信封在使用前 都要滅菌 。（ 2）制備培養(yǎng)基：按下列配方制備以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基。KH 2PO4Na2HPO4MgSO 4 7H2O葡萄糖尿素瓊脂pH 調(diào)至7.0 7.2，加蒸餾水定容至1000ml1.4g2.1g0.2g10.0g1.0g15.0g需要設(shè)置無尿素 培養(yǎng)基 作空白對照，即：表中尿素用等量的無菌水 替換。3）土壤樣品稀釋：制備 不同稀釋度的土壤懸液。方法如下：稱取 0.5g 土壤 ， 倒入盛有50mL 無菌水的錐形瓶，振蕩20min， 充分打散土壤，制成10 2g/mL 的土壤懸液。用

3、無菌移液管吸取0.5mL（ 10 2g/mL）的土壤懸液注入盛有4.5mL無菌水 的號 試管，配制成10 3g/mL 的土壤懸液。取另一支無菌移液管吹吸 1 號管 3次 ，使懸液均勻，再吸取 0.5mL注入盛有.5mL 無菌水 的 2號 試管，配制成10 4g/mL的土壤懸液.。 依此類推 ，配制10 5、 10 6、 10 7、 10 8g/mL 的等濃度的土壤懸液。每次吸取土壤懸液前都要用移液管吹吸懸液3 次 的 目的 ： 使土壤懸液均勻 。 分離 不同的微生物采用不同稀釋度（因不同微生物在土壤中含量不同 ） 。見下表：細菌放線菌霉菌稀釋度104、 105、 106103、 104、 10

4、5102、 103、 104目的保證 獲得菌落數(shù)在30 300之間 、適于計數(shù)的平板【提醒】人教版是配制10mL不同濃度的土壤懸液，其方法與上述方法相同。4）接種：采用（稀釋）涂布平板法。具體操作如下：從 最低濃度 （ 10 8g/mL）土壤溶液開始 ，分別用無菌移液管吸取1mL（ 人教版為 0.1mL）加入到相應(yīng)編號 的培養(yǎng)基中，每個濃度設(shè)置至少3 個 重復（三個平板） ，再用 涂布器 （玻璃刮鏟）涂布均勻 。每次吸取土壤懸液前都要將土壤懸液充分振蕩 ， 混合均勻 ；每一步都應(yīng)做到無菌 操作。操作時，移液管和試管口應(yīng)在離火焰1 2cm處 。實驗時要對培養(yǎng)皿作好標記 。 注明 培養(yǎng)基類型、 培

5、養(yǎng)時間 、 稀釋度 、 培養(yǎng)物 等。5）培養(yǎng)與觀察：將已標明培養(yǎng)基種類、培養(yǎng)日期和樣品稀釋度的培養(yǎng)皿，倒置 放在 37 的 恒溫箱 培養(yǎng) 1 2d，觀察細菌菌落。（ 6）計數(shù)菌落：每隔 24h 統(tǒng)計菌落一次，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時的數(shù)據(jù)作結(jié)果，以防 TOC o 1-5 h z 止培養(yǎng)時間不足而遺漏某些菌落。 計算時 應(yīng)選擇 菌落數(shù) 為 30 300 的平板上 進行計數(shù) ， 要計算平均數(shù)。 每克樣品菌落數(shù)（用液1mL） 某一稀釋度重復培養(yǎng) 菌落 平均數(shù) 稀釋倍數(shù) 。統(tǒng)計的菌落數(shù)比活菌的實際數(shù)目少。原因 是： 當 兩個 或 多個細胞 連在一起時，平板上觀察到的只是1 個菌落 。結(jié)果分析與評價： 同一土

6、樣 的重復組統(tǒng)計的結(jié)果應(yīng)相近 。若 未接種 的培養(yǎng)基中沒有菌落 ，說明培養(yǎng)基未被雜菌污染，反之，則被污染 。若 空白對照組培養(yǎng)基上 有菌落生長， 原因 可能是 被固氮微生物污染或培養(yǎng)基中混入了其他氮源。若實驗中得到2 個 或 2 個以上 菌落數(shù)在30 300 的平板，表明稀釋 操作 成功 ， 可以進行計數(shù)統(tǒng)計。若同一稀釋度的3 個重復的菌落數(shù)相差懸殊 ，表明試驗不精確 ，需要 重新實驗 ?！局R拓展】1土壤中微生物數(shù)目的統(tǒng)計方法：包括： 直接計數(shù)法和 間接計數(shù)法（ 活菌計數(shù)法） 。（ 1）直接計數(shù)法：用 血球計數(shù)板制片后在 顯微鏡下 觀察計數(shù)。取樣計數(shù)方法與培養(yǎng)液中酵母菌計數(shù)方法類似 。土壤微

7、生物的稀釋要求 ： 以達到 每小格內(nèi)有 5 10 個菌體為宜。經(jīng)稀釋的土壤樣品應(yīng)重復計數(shù)3 次 ，取其 平均值 。 1mL土壤懸液中菌體總數(shù)= 4 106 每小格 中的 菌體數(shù) 土壤懸液 稀釋倍數(shù) 。（ 2）間接計數(shù)法（活菌計數(shù)法）采用 稀釋涂布平板法，統(tǒng)計 菌落數(shù) 進行計數(shù)。要設(shè)置對照和重復，每個稀釋度土壤懸液至少 設(shè)置 3 個 重復 。選擇 菌落數(shù) 為 30 300 的平板上 進行計數(shù) ，并 計算平均數(shù)。每克土壤樣品中菌落數(shù)菌落數(shù) 稀釋倍數(shù) 涂布體積 。鑒定能分解尿素的微生物的方法： 脲酶檢測法。1）原理： 尿素經(jīng)脲酶分解后形成氨，使 pH升高，會使 酚紅 指示劑 變紅 。2）方法：在 以

8、尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅 ，若酚紅指示劑變紅 ，則 TOC o 1-5 h z 說明該微生物能分解尿素。（三）分離土壤中能分解纖維素的微生物：基礎(chǔ)知識和原理：能分解纖維素的微生物都能分泌纖維素酶 ，該類微生物能以纖維素為唯一碳源。維素酶：是 一種復合酶， 包括：C1 酶 （ 外切酶 ） 、 CX酶 （ 內(nèi)切酶 ）和 葡萄糖苷酶。纖維素C1 酶、CX酶纖維二糖葡萄糖苷酶葡萄糖剛果紅： 能與纖維素 形成 紅色復合物， 不能與纖維二糖和 葡萄糖 發(fā)生這種反應(yīng)。 在含有纖維素的培養(yǎng)基中加入剛果紅時，能分解纖維素的微生物形成的菌落周圍 由于 纖維素被分解，因此 不呈紅色，而是 形成透明圈。操作步

9、驟：（ 1）土壤取樣：應(yīng)從 富含纖維素的環(huán)境中進行土壤取樣。如：樹林中多年落葉形成的腐殖土等。若找不到合適的環(huán)境，可將 濾紙埋在土壤中（深10cm）再取樣。2）選擇培養(yǎng)： 目的 ： 增加纖維素分解菌 的 濃度 （即： 濃縮 所需要微生物）按下表配方制備液體 選擇培養(yǎng)基：纖維素粉5gNa2HPO4 7H2O1.2g溶解后加蒸餾水定容至1000mLNaNO31gKH 2PO40.9gKCL0.5g酵母膏0.5gMgSO47H2O0.5g水解酪素0.5g提醒 】 該培養(yǎng)基為液體 培養(yǎng)基，屬于選擇 培養(yǎng)基。 原因 是： 該培養(yǎng)基中雖然含有其他碳源（酵母膏 ） ，但 含量很少 ，培養(yǎng)基中的主要碳源還是纖

10、維素 ；在此種培養(yǎng)基中只有能分解纖維素的微生物 才能大量繁殖。 水解酪素 ： 提供 氮源 和 生長因子 。設(shè)計對照組培養(yǎng)基時，用葡萄糖 代替 該配方中 纖維素粉 ?！静僮鳌糠Q取 20g 土樣加入裝有30mL選擇培養(yǎng)基的錐形瓶中，將錐形瓶固定在搖床上 ， 在一定溫度下（ 30 ） ， 振蕩培養(yǎng)1 2 天， 直至培養(yǎng)液變渾濁 。3）梯度稀釋： 將 選擇培養(yǎng)后的培養(yǎng)基進行等梯度 稀釋101 107倍。4）將樣品涂布到鑒別纖維素分解菌的培養(yǎng)基上：制備鑒別培養(yǎng)基：按下表配方制備鑒別培養(yǎng)基。CMC Na（ 水溶性羧甲基纖維素鈉）酵母膏KH 2PO4土豆汁瓊脂溶解后加蒸餾水定容至1000ml5 10g1g0

11、.25g100mL15g涂布平板： 將稀釋度為104 106的菌懸液各取0.1ml 涂布到平板培養(yǎng)基上， TOC o 1-5 h z 30倒置培養(yǎng)。5）剛果紅染色法： 目的 ： 挑選產(chǎn)生透明圈的菌落 （篩選出纖維素分解菌）方法一 ： 先培養(yǎng)微生物， 再加入剛果紅進行顏色反應(yīng)。方法二 ：在 倒平板時就加入剛果紅。方法一中要使用NaCl 溶液 ，其 作用 是： 漂洗作用 。即： 洗去 與纖維素結(jié)合不牢的剛果紅 ， 使透明圈更清晰。 透明圈越大的 菌落 ， 產(chǎn)纖維素酶能力越強，分解纖維素的能力越強 。 兩種染色鑒定方法的優(yōu)缺點比較：染色法優(yōu)點缺點方法一顏色反應(yīng)基本上是 纖維素分解菌的作用操作繁瑣，剛果紅會使菌落之間發(fā)生混雜。操作簡便，產(chǎn)生淀粉酶的微生物也產(chǎn)生模糊透明圈方法二不存在菌落混雜問題有些微生物能降解色素，形成明顯的透