轉(zhuǎn)基因育種技術PPT

1、關于轉(zhuǎn)基因育種技術第一張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月第一節(jié) 轉(zhuǎn)基因育種的概念 一、植物遺傳轉(zhuǎn)化（植物基因工程） 以植物為對象，采用重組DNA技術，將外源目的基因?qū)胧荏w植物基因組，最后獲得外源目的基因正確表達和穩(wěn)定遺傳的新植物類型。 核心技術是重組DNA技術 第二張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月 重組DNA（recombinant DNA）：是指人工創(chuàng)造的自然界中不存在的DNA分子。主要指利用不同生物來源的DNA分子拼接的雜種DNA分子。 其過程包括如下幾個步驟： 從細胞或組織獲得DNA并純化用限制酶切割DNA將獲得的限制片段連接到載體上，外源DNA片段與載體連接后形成的雜種

2、DNA分子稱為重組DNA分子重組DNA導入宿主細胞，在宿主細胞內(nèi)重組DNA分子復制，產(chǎn)生大量相同拷貝的重組DNA分子，稱為克隆克隆的DNA分子可以從宿主細胞中回收，純化克隆的DNA可以轉(zhuǎn)錄和翻譯，其產(chǎn)品可以被分離出來用于研究或商業(yè)開發(fā)第三張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月二、轉(zhuǎn)基因育種 將植物遺傳轉(zhuǎn)化和常規(guī)育種技術相結合，培育具有特定目標性狀的植物新品種。 第四張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)基因育種技術的一般實驗流程目的基因的克隆與鑒定轉(zhuǎn)化載體的構建E.Coli轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒抽提與鑒定農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化與活化外植體制備浸 染選擇培養(yǎng)共培養(yǎng)移栽繼代繁殖分子檢測生理檢測純化第五張，PPT共

3、九十頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)基因技術與傳統(tǒng)技術的關系 二者本質(zhì)都是通過獲得優(yōu)良基因進行遺傳改良。 在基因轉(zhuǎn)移的范圍和效率上有兩點重要區(qū)別：第一，傳統(tǒng)技術一般只能在生物種內(nèi)個體間實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)移，而轉(zhuǎn)基因技術所轉(zhuǎn)移的基因則不受生物體間親緣關系的限制。 第六張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月第二，傳統(tǒng)技術是在生物個體水平上進行，操作對象是整個基因組，所轉(zhuǎn)移的是大量的基因，不可能準確地對某個基因進行操作和選擇，對后代的表現(xiàn)預見性較差。 轉(zhuǎn)基因技術轉(zhuǎn)移的是經(jīng)過明確定義的基因，功能清楚，后代表現(xiàn)可準確預期，因此，轉(zhuǎn)基因技術是對傳統(tǒng)技術的發(fā)展和補充。第七張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月將兩者緊

4、密結合，可相得益彰，提高作物品種遺傳改良的效率。 第八張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月9 第二節(jié) 目的基因的獲得 根據(jù)獲得基因的途徑主要可以分為兩大類： 根據(jù)基因表達的產(chǎn)物蛋白進行基因克??； 從基因組DNA或mRNA序列克隆基因。 根據(jù)基因表達的產(chǎn)物蛋白進行基因克隆 主要步驟如下：利用這種方法人類首次人工合成了胰島素基因。雖然在早期采用這種方式已經(jīng)成功地克隆了許多基因。局限性：兼并密碼子 效率低 未知基因及產(chǎn)物分離蛋白質(zhì)明確氨基酸序列推導核苷酸序列人工合成第九張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月第三節(jié) 植物遺傳轉(zhuǎn)化的受體系統(tǒng)受體:是指用于接受外源DNA的轉(zhuǎn)化材料。受體系統(tǒng):是指用于

5、基因轉(zhuǎn)化的外植體通過細胞或其 他組織培養(yǎng)途徑，能高效、穩(wěn)定地再生無性 系，并能接受外源DNA整合、轉(zhuǎn)化選擇對抗 生素敏感的再生系統(tǒng)。轉(zhuǎn)化的主要目的:外源DNA穩(wěn)定地插入植物細胞的染 色體組中，并再生出完整的植株。 第十張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月11良好的植物基因轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)應滿足如下條件：1、必須具有脫分化和再生能力，能夠形成新的植物體。高 效穩(wěn)定的再生能力；2、受體材料要有較高的遺傳穩(wěn)定性；3、外植體來源方便，如胚和其它器官等；4、對篩選劑敏感；5、能夠接受外源基因，并通過基因重組或其它途徑使外源 基因穩(wěn)定地插入植物染色體組,轉(zhuǎn)化率高第十一張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6

6、月12常用的受體材料有以下幾大類型:1.愈傷組織再生系統(tǒng)外植體材料經(jīng)過脫分化培養(yǎng)誘導形成愈傷組織，轉(zhuǎn)化（帶有目的基因質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染），分化培養(yǎng)獲得再生植株。優(yōu)點：外植體來源廣，繁殖快，易接受外源基因， 轉(zhuǎn)化效率高。缺點：遺傳穩(wěn)定性差、嵌合體，因此需要連續(xù)的再生系統(tǒng)第十二張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月132.直接分化再生系統(tǒng) 外植體材料細胞不經(jīng)過脫分化形成愈傷組織階段，而是直接分化出不定芽形成再生植株。 現(xiàn)已建立了一些植物幼芽、胚軸、莖尖分生組織等外植體誘導形成直接分化芽再生體系。優(yōu)點：周期短、操作簡單，體細胞變異小，遺傳穩(wěn)定；缺點：材料局限，轉(zhuǎn)化率低。第十三張，PPT共九十頁，創(chuàng)作

7、于2022年6月3.原生質(zhì)體再生系統(tǒng)原生質(zhì)體恢復細胞壁具有分化再生能力，是應用最早的再生受體系統(tǒng)之一。優(yōu)點：高效、廣泛地攝取外源DNA或遺傳物質(zhì)，獲得 基因型一致的克隆細胞，所獲轉(zhuǎn)基因植株嵌合 體少，適用于多種轉(zhuǎn)化系統(tǒng)；缺點：不易制備、再生困難和變異程度高。第十四張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月154.胚狀體再生系統(tǒng) 是指經(jīng)體細胞培養(yǎng)形成的在形態(tài)結構和功能上類似于有性胚的結構，又稱體細胞胚。優(yōu)點：個體數(shù)目巨大、同質(zhì)性好，接受外源基因能力 強，嵌合體少，易于培養(yǎng)、再生。缺點：技術含量高，多數(shù)植物不易獲得胚狀體。第十五張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月5.生殖細胞受體系統(tǒng)以生殖細胞如

8、花粉粒、卵細胞等受體細胞進行外源基因轉(zhuǎn)化的系統(tǒng)。一是利用組織培養(yǎng)技術進行小孢子和卵細胞的單倍體培養(yǎng)、轉(zhuǎn)化受體系統(tǒng)；二是直接利用花粉和卵細胞受精過程進行基因轉(zhuǎn)化，如花粉管導入法、花粉粒浸泡法、子房微針注射法等。第十六張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月優(yōu)點：生殖細胞不僅具有全能性，而且接受外源遺傳 物質(zhì)的能力強，導入外源基因成功率高，更易 獲得轉(zhuǎn)基因植株。又因生殖細胞是單細胞，轉(zhuǎn) 化的基因五顯隱性影響，外源目的基因充分表 達。因此利用生殖細胞作為轉(zhuǎn)基因受體與單倍 體育種技術相結合，可簡化和縮短育種純化過 程。缺點：獲得單細胞只能在開花期，常受到季節(jié)及生長 條件的限制。第十七張，PPT共九十頁

9、，創(chuàng)作于2022年6月 第四節(jié) 植物遺傳轉(zhuǎn)化的載體系統(tǒng)一、載體的概念 載體（vector）:將外源基因送入受體細胞的工具 本質(zhì)是一段DNA分子,是指能在連接酶作用下和外源DNA片段或基因連接，并運送DNA分子進入受體細胞的DNA分子。二、載體的功能 作為植物基因轉(zhuǎn)化的載體，必須具有兩種功能： 一是它能作為媒介將外源基因?qū)氲街参锛毎腥?，并且整合到宿主細胞的基因組DNA上 二是它能提供被寄主細胞的復制和轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)所識別的DNA序列，即啟動子和復制子起始位點，以保證轉(zhuǎn)化的外源基因能在植物細胞中進行復制和表達。第十八張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月四、植物基因工程常用載體質(zhì)粒(plasmid

10、)；病毒載體(virus vector)；噬菌體(phage)；酵母載體(yeast vector)；以病毒載體和質(zhì)粒載體介導的遺傳轉(zhuǎn)化比較多。 第十九張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月五、Ti質(zhì)粒 有一種土壤細菌,稱為農(nóng)桿菌，它能誘導植物傷口形成冠癭瘤，細菌的致瘤能力來源于細菌內(nèi)的一個額外染色體即質(zhì)粒(plasmid)，稱Ti質(zhì)粒。 還有一種細菌稱發(fā)根農(nóng)桿菌,決定毛根癥的質(zhì)粒為Ri質(zhì)粒，即誘發(fā)寄主植物產(chǎn)生毛根 . Ti和Ri質(zhì)粒是理想的基因克隆載體，通過它們可以將外源的DNA轉(zhuǎn)移到植物細胞，并再生出能夠表達外源基因的轉(zhuǎn)基因植物。第二十張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月 Ti質(zhì)粒是

11、根癌農(nóng)桿菌染色體外的遺傳物質(zhì)，為雙股共價閉合的環(huán)狀DNA分子，約有150-200kb大小。在病原菌致病過程中，其中的一段DNA分子（T-DNA）能夠插入到植物基因組中并能夠穩(wěn)定表達。 第二十一張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月 根據(jù)其誘導的植物冠癭瘤中所合成的冠癭堿種類不同，Ti質(zhì)?？梢员环殖伤姆N類型：章魚堿型胭脂堿型農(nóng)桿堿型農(nóng)桿菌素堿型（或稱琥珀堿型）第二十二張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月不同類型的Ti質(zhì)粒都具有:（1）TDNA區(qū)（transferred-DNA regions）： T-DNA是農(nóng)桿菌侵染植物細胞時，從Ti質(zhì)粒上切割下來轉(zhuǎn)移到植物細胞的一段DNA，故稱之為轉(zhuǎn)移

12、DNA。該DNA片段上的基因與腫瘤的形成有關。（2）Vir區(qū)（virulence region）： 該區(qū)段上的基因能激活T-DNA轉(zhuǎn)移，使農(nóng)桿菌表現(xiàn)出毒性，故稱之為毒性區(qū)。T-DNA區(qū)與Vir區(qū)在質(zhì)粒DNA上彼此相鄰，合起來約占Ti質(zhì)粒DNA的三分之一。第二十三張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）Con區(qū)（regions encoding conjugations）： 該區(qū)段上存在著與細菌間接合轉(zhuǎn)移相關基因（tra），調(diào)控Ti質(zhì)粒在農(nóng)桿菌之間的轉(zhuǎn)移。冠癭堿能激活tra基因，誘導Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移，因此稱之為接合轉(zhuǎn)移編碼區(qū)。（4）Ori區(qū)（origin of replication）： 該區(qū)

13、段基因調(diào)控Ti質(zhì)粒的自我復制起始。第二十四張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月第五節(jié) 基因轉(zhuǎn)導方法將目的基因?qū)胧荏w細胞（植物細胞）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法基因槍法花粉管通道法第二十五張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月 遺傳轉(zhuǎn)化分為兩種：一種是生物載體介導的遺傳轉(zhuǎn)化；一種是非生物載體介導的遺傳轉(zhuǎn)化。就非載體轉(zhuǎn)化而言，該系統(tǒng)又可以分為兩種類型：種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)和直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng)。種質(zhì)轉(zhuǎn)化系統(tǒng)：以植物自身的生殖系統(tǒng)種質(zhì)細胞，如花粉粒通道法。直接轉(zhuǎn)化系統(tǒng)：不用任何載體，采用物理化學方法直接將外源基因?qū)胧荏w細胞，如基因槍法、脂質(zhì)體法、超聲波法等。第二十六張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月1、農(nóng)桿菌介導的

14、基因轉(zhuǎn)移（1）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的寄主范圍 根癌農(nóng)桿菌和發(fā)根農(nóng)桿菌的寄主范圍很廣，目前已知有90多科、600余種植物可以感染。如煙草、大豆、棉花、馬鈴薯、油菜、花生、番茄、蘋果、楊樹等用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化都先后獲得成功。遺憾的是大部分單子葉植物很少或完全不能產(chǎn)生激活Ti質(zhì)粒Vir區(qū)基因的信號分子。為了克服根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化單子葉植物的障礙，許多研究者對感染的合適部位和轉(zhuǎn)化方法進行了探討，并發(fā)現(xiàn)乙酰丁香酮和其它酚類化合物可促進大麥、小麥等很多單子葉植物的轉(zhuǎn)化。經(jīng)過不懈努力，科學家用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化重要的單子葉植物如水稻、玉米、小麥等都取得了成功。一、載體介導的轉(zhuǎn)化方法 根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導的轉(zhuǎn)基因方法是目前研究最多、機

15、理最清楚、技術方法最成熟的轉(zhuǎn)基因方法。第一批表達外源基因的轉(zhuǎn)基因植物就是用根癌農(nóng)桿菌介導法獲得的。迄今所獲得的200多種轉(zhuǎn)基因植物中，80%以上是利用根癌農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒介導的轉(zhuǎn)基因方法產(chǎn)生的。第二十七張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月 農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化首先要求植物外植體能夠產(chǎn)生乙酰丁香酮或其它能夠誘導Vir區(qū)基因的活性物質(zhì)。 其次是農(nóng)桿菌能夠接近具有再生能力的感受態(tài)細胞。（2）農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的方法第二十八張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月 可用于農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化的外植體種類很多，從單細胞（通常是原生質(zhì)體）、懸浮培養(yǎng)細胞和愈傷組織（未分化的胚性細胞）、薄壁細胞層、組織切片（如蘿卜韌皮部和馬鈴薯塊莖薄

16、壁組織）到各種植物器官，如葉、根、莖和花組織的切段等。 第二十九張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月基因轉(zhuǎn)移技術的一般操作 以根瘤農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化雙子葉植物葉片為例1.將表面消毒的葉片切成小塊2.小塊在過夜培養(yǎng)并稀釋到一定濃度的根癌農(nóng)桿菌液中浸泡幾分鐘，以便讓根癌農(nóng)桿菌感染葉片切塊的傷口。3.從菌液中撈出小塊，培養(yǎng)基中培養(yǎng)2天。4.在含頭孢霉素選擇培養(yǎng)基中篩選轉(zhuǎn)化細胞。繼續(xù)培養(yǎng)，轉(zhuǎn)化的細胞分化出芽。5.將芽轉(zhuǎn)入含有抗生素的生根培養(yǎng)基上，誘導生根。6.將完整的轉(zhuǎn)基因植株移栽到土壤中。第三十張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月 該方法是Marton等1979年以原生質(zhì)體為受體建立起來的，隨后經(jīng)過

17、一系列的改進，現(xiàn)在是植物基因工程中最常用的一種轉(zhuǎn)化方法。該方法的主要原理是將受體與供體在一起培養(yǎng)，通過接觸感染而發(fā)生轉(zhuǎn)移，供體常用農(nóng)桿菌、病毒載體等形式。 A.原生質(zhì)體共培養(yǎng)法 取含重組Ti質(zhì)粒的農(nóng)桿菌同剛剛長出細胞壁的原生質(zhì)體作短暫的共培養(yǎng)，促使農(nóng)桿菌和植物細胞之間發(fā)生遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化。第三十一張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月從煙草無菌苗中分離原生質(zhì)體，并預培養(yǎng)24小時。原生質(zhì)體與農(nóng)桿菌混合培養(yǎng)，原生質(zhì)體濃度l05ml、農(nóng)桿菌l07ml，20下保溫32小時。沖洗去游離的細菌，將原生質(zhì)體培養(yǎng)在有抗生素(250mgL萬古霉素，200mgL羧芐青霉素，200mgL鏈霉素)的培養(yǎng)基中，這些抗生

18、素抑制細菌生長，而對原生質(zhì)體無毒害。3周后，離心收集細胞團，再培養(yǎng)在無激素培養(yǎng)基上，2周內(nèi)，轉(zhuǎn)化的細胞團是激素非依賴性生長細胞團，在該培養(yǎng)基中可快速生長，而非轉(zhuǎn)化的細胞團則生長很慢，最后變褐死亡。 煙草原生質(zhì)體與Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)移的共培養(yǎng)法程序為：第三十二張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月B.葉盤共培養(yǎng)法 圖 該方法最早由Horsch(1985)首創(chuàng)，并已被成功地用于煙草、番茄、矮牽牛和楊樹等植物的轉(zhuǎn)化。其步驟是用打孔器取得葉圓片（直徑2-5毫米），在過夜培養(yǎng)并調(diào)整到合適濃度的農(nóng)桿菌菌液中浸泡4-5分鐘，置于培養(yǎng)基上共培養(yǎng)23天，在轉(zhuǎn)移到含有選擇劑的培養(yǎng)基上，使轉(zhuǎn)化細胞直接再生植株。葉圓片法經(jīng)

19、過改良可以用于莖段、葉柄和萌發(fā)種子等其它外植體的轉(zhuǎn)化。優(yōu)點：適用性廣，對于那些能被農(nóng)桿菌感染的、并能從葉子再生植株的各種植物均適用。第三十三張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月 把轉(zhuǎn)化外植體，如莖段、幼胚、懸浮培養(yǎng)細胞等農(nóng)桿菌在一起培養(yǎng)2448h，用無菌水沖洗數(shù)次，洗去農(nóng)桿菌，將材料轉(zhuǎn)入含有抑菌劑（如cefotaxime等）的培養(yǎng)基中培養(yǎng)，選擇轉(zhuǎn)化體。C.共培養(yǎng)法 原則上，該種共培養(yǎng)與原生質(zhì)體共培養(yǎng)的方法和步驟是相同的，在供體上，則必須是有侵染和感染能力的載體系統(tǒng)，如帶有Ti質(zhì)粒的根癌農(nóng)桿菌。 第三十四張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月 又稱整體植株接種轉(zhuǎn)化法，是指人為地在整體植株上

20、造成創(chuàng)傷部位，然后把農(nóng)桿菌接種在創(chuàng)傷表面，或用針頭把農(nóng)桿菌注射到植物體內(nèi)，使農(nóng)桿菌按照天然的感染過 程在植物體內(nèi)進行侵染，獲得轉(zhuǎn)化的植物愈傷組織或轉(zhuǎn)基因植株。接種后2-3周，切下接種處部分組織培養(yǎng)4周，可產(chǎn)生愈傷組織，進一步通過分化培養(yǎng)可獲得轉(zhuǎn)基因植株。D.直接接種法優(yōu)點：方法簡便，實驗周期短，因培養(yǎng)基不與農(nóng)桿菌直接接觸，故污染較少。 第三十五張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月二、DNA直接導入的基因轉(zhuǎn)化技術 DNA直接導入的基因轉(zhuǎn)化技術：是指不依賴農(nóng)桿菌載體和其它生物媒體，將外源目的基因直接導入植物細胞，實現(xiàn)基因轉(zhuǎn)化的技術，又稱為無載體介導轉(zhuǎn)化。這為不易通過農(nóng)桿菌等載體介導轉(zhuǎn)化的植物提

21、供了外源基因?qū)氲挠行緩健８鶕?jù)DNA導入機理可分為：化學法：是以原生質(zhì)體為受體，借助特定的化學物質(zhì)誘導DNA直接導入植物細胞的方法。目前主要有PEG法和脂質(zhì)體法。 物理法：是基于許多物理因素對細胞膜的影響或通過機械損傷直接將外源DNA導入細胞。原生質(zhì)體、細胞、組織及器官均可作為外植體，比化學法更具廣泛性和實用性。常用的方法有基因槍法、超聲波法、電擊法等。 第三十六張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月1、物理方法（1）基因槍法 80年代末期，由康奈爾大學的Sanford最先提出，主要是為了克服以往各種基因轉(zhuǎn)化技術的局限。該方法是利用一種物理儀器裝置，將鎢、金等金屬微粒加速沖擊細胞，把細胞擊

22、孔，使目的基因進入受體。 第三十七張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月操作技術程序為：基因槍示意圖 首先將鎢、金微粒(直徑約0.4m，重量約0.05mg)與供體DNA溶液(12l)混合并保溫，使DNA吸附在金屬微粒的表面，然后將該溶液置于所謂的“基因槍”儀器中，儀器高壓放電將金屬微粒加速，直接噴射受體原生質(zhì)或細胞，細胞擊穿成孔后，在鎢粒上的DNA以及溶液中的DNA都可以進入受體細胞。 第三十八張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月基因槍所用材料：（1）鎢粉使用起來經(jīng)濟實惠，也可以得到較好的轉(zhuǎn)化效果；但容易被氧化，顆粒易聚集，并且對植物細胞的毒害也比金粉大。（2）將DNA包被到微載體上所用

23、的試劑有亞精胺、CaCl2、乙醇、聚乙二醇、異丙醇等，但多用前兩種。（3）所用動力系統(tǒng)：一類以火藥爆炸力作為動力加速微彈；另一類以電弧放電蒸發(fā)液滴作為動力；第三類以高壓蒸汽作為動力。基因槍法的特點：（1）轉(zhuǎn)化效率高。 （2）受體廣泛。（3）操作簡單。第三十九張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月基因槍法缺點與農(nóng)桿菌介導法比，轉(zhuǎn)化效率低形成的嵌合體多結果的重復性差遺傳穩(wěn)定性差儀器昂貴成本高若與農(nóng)桿菌法結合，可提高轉(zhuǎn)化效率第四十張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月（2）電激法(electroperation) 又稱電穿孔發(fā)，是利用高壓電脈沖的作用對原生質(zhì)體或細胞擊出微孔而使基因轉(zhuǎn)移的一種新方

24、法。 原理：細胞生物學研究證明，細胞膜的磷脂雙分子層可視為一種電容，其靜膜電位（Vm）約為l00mV，導電性很差。當把細胞置于外加電場中時，會使膜電位升高，雙分子層兩端電壓形成差勢，隨著外加電場電壓升高，細胞膜被壓縮變薄，當膜電壓升到一定數(shù)值時，膜被擊穿，形成短暫性可逆性的開閉通道，外源DNA進入細胞。 電轉(zhuǎn)儀第四十一張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月（3）微注射法（micro-injection） 微量注射：用注射針或微針在受體細胞或組織穿刺成孔，DNA隨穿刺孔進入細胞或隨穿刺針頭道進入。 真正的顯微注射：利用顯微注射儀，通過機械方法把外源DNA直接注入細胞質(zhì)或細胞核的基因轉(zhuǎn)化方法。

25、第四十二張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月 直接注射法：是用注射針直接將大量的DNA注入植物組織或器官達到轉(zhuǎn)化的目的，如子房、分蘗節(jié)、幼穗等，又稱宏量注射法。 在注射過程中，針尖往往摧毀了被注射的細胞，因此該法試圖利用與被注射細胞鄰近的組織細胞吸收外源DNA。第四十三張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月（4）激光微束法(laser microbeam) （5）超聲波法 此方法是利用直徑很小、能量很高的激光微束引起細胞膜可逆性穿孔的原理，在熒光顯微鏡下找出合適的細胞，然后用激光光源代替熒光光源，聚焦后發(fā)出激光微束脈沖，造成膜穿孔，處于細胞周圍的外源DNA分子隨之進入細胞?；驹恚菏抢?/p>

26、用低聲強脈沖超聲波的物理作用，擊穿細胞膜造成通道，使外源DNA進入細胞。 利用超聲波處理可避免脈沖高壓對細胞的損傷作用，有利于原生質(zhì)體的存活，是一種有潛力的轉(zhuǎn)化途徑。（6）離子束法 離了束作用在生物表面后可引起電子濺射，離子束的濺射好象一把手術刀，對生物體進行微細加工，使生物體表面層層剝離，原來不連通的通道在一定距離內(nèi)連通，后來的離子就可穿行較長的距離，落在預定的位置上。 第四十四張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月（7）碳化硅纖維介導DNA轉(zhuǎn)移法 是簡單、快速、經(jīng)濟的導入DNA進入植物完整細胞的方法。 應用直徑為0.6微米、長度為10-80微米的碳化硅纖維，使附著于纖維或細胞壁上的DNA

27、，借助與在漩渦震蕩引起的相互碰撞過程中纖維對細胞的穿刺作用進入細胞，實現(xiàn)轉(zhuǎn)化。（8）DNA卵育法（又稱浸泡法）利用供體DNA溶液與受體的種子、幼胚、幼穗、及幼苗等器官的接觸，使外源DNA進入受體細胞內(nèi)，然后與受體細胞基因組重組，產(chǎn)生轉(zhuǎn)化效果。方法：浸種、浸苗、浸胚、浸芽特點：簡單、快速、方便第四十五張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月2化學方法 （1）PEG法 是細胞融合劑，它可以使細胞膜之間或DNA與膜之間形成分子橋，促使相互之間的接觸和粘連，即具有細胞粘合作用；PEG還可以引起膜表面電荷的紊亂，干擾細胞間的識別，因而能促進原生質(zhì)體融合和改變細胞膜的通透性，從而有利于外源DNA進入原生質(zhì)

28、體，實現(xiàn)基因遺傳轉(zhuǎn)化。第四十六張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月 脂質(zhì)體是由人工構建的磷脂雙分子層組成的膜結構，可將DNA包在其內(nèi)，并通過脂質(zhì)體與原生質(zhì)體的融合或由于原生質(zhì)體的吞噬過程，把外源DNA轉(zhuǎn)運到細胞內(nèi)。(2)脂質(zhì)體法第四十七張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月3.花粉管通道法（pollen-tube pathway system） 原理是授粉后使外源DNA能沿花粉管滲入，經(jīng)過珠心通道進入胚囊，轉(zhuǎn)化尚不具備正常細胞壁的卵、合子或早期胚胎細胞?；ǚ酃芡ǖ婪ㄞD(zhuǎn)化實質(zhì)是受精過程轉(zhuǎn)化?；ǚ哿Ｔ谥^上萌發(fā)形成花粉管，不斷向胚囊伸長，滴注在柱頭上的外源DNA隨著花粉管進入胚囊 。花粉管通

29、道法是由周光宇等(1978)建立并在長期科學研究中發(fā)展起來的。第四十八張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月通過花粉管通道常用的外源基因?qū)敕椒ˋ.柱頭滴注法 將外源DNA溶液直接滴于授粉后2-3小時的柱頭上，或?qū)⑹诜酆笾^切除一部分，在切除處花粉管孔處滴加外源DNA。B.花粉粒與外源DNA混合授粉法 將DNA溶液與適量新鮮花粉迅速混合成糊狀，立即涂在柱頭上，套袋隔離至種子成熟?；?qū)NA溶液涂在柱頭上，然后立即將采集的花粉灑落在柱頭上。C.花粉粒培養(yǎng)法 取新鮮的花粉灑落在柱頭上，待萌發(fā)時取下加入外源DNA溶液中混均后在涂在柱頭上。D.花粉粒轉(zhuǎn)化法 又稱花粉攜帶發(fā)，先用農(nóng)桿菌、基因槍、微注射

30、等方法將外源DNA導入花粉粒，涂在柱頭上。第四十九張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月50第六節(jié) 轉(zhuǎn)化植株的檢測與鑒定外源目的基因轉(zhuǎn)化頻率低 如何選擇和篩選轉(zhuǎn)化體是一個重要問題。 第五十張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月一、選擇標記基因 外源目的基因轉(zhuǎn)化頻率低，目的基因已被整合到核基因組并表達轉(zhuǎn)化細胞更少，使用特異性選擇標記基因（selectable marker genes）進行標記，有效地選擇出真正轉(zhuǎn)化細胞。 表達載體的組成目的基因啟動子終止子標記基因第五十一張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月原理：選擇標記基因的主要功能是該基因的產(chǎn)物給予植物細胞一種選擇壓力，致使未轉(zhuǎn)化細胞

31、在施用選擇劑條件下不能生長、發(fā)育與分化，而轉(zhuǎn)化細胞對該選擇劑產(chǎn)生抗性，不影響其生長、發(fā)育，從而將轉(zhuǎn)化細胞及植株選擇出來。第五十二張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月必須具備以下四個條件：編碼一種不存在于正常植物細胞中的酶；基因較小，可構成嵌合基因；能在轉(zhuǎn)化體中得到充分表達；檢測容易，并且能定量分析。第五十三張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月54 常用選擇標記基因： 編碼抗生素的抗性基因 編碼除草劑的抗性基因 將選擇標記基因與適當啟動子構成嵌合基因，克隆到質(zhì)粒載體上，與目的基因同時進行轉(zhuǎn)化。標記基因在受體細胞表達，使轉(zhuǎn)化細胞具有抵抗相應抗生素或除草劑的能力而存活下來。非轉(zhuǎn)化細胞則被抑制

32、、殺死。第五十四張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月 常用選擇標記基因： 編碼抗生素的抗性基因:新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因II（nptII），編碼新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶II（nptII），抗代謝物（選擇劑）為卡那霉素（Kanr）、新霉素（Neor）、氨基葡萄糖苷（Aphr）。 編碼除草劑的抗性基因 ：PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶基因（Pat），又稱bar基因，編碼PPT乙酰轉(zhuǎn)移酶，抗草丁膦、雙丙氨膦。 第五十五張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月 常用的抗生素有：氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、鏈霉素等；將經(jīng)過轉(zhuǎn)化后的細胞在選擇性培養(yǎng)基中培養(yǎng)，才能較容易地篩選出轉(zhuǎn)化體，即帶有異源DNA分子的受體細胞。否

33、則，如果將轉(zhuǎn)化后的菌液涂在無選擇性抗生素的培養(yǎng)基平板上，會出現(xiàn)成千上萬的細菌菌落，將難以確認哪一個克隆含有轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒。第五十六張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月二、報告基因： 植物基因工程中，常采用另一類標記基因來檢測轉(zhuǎn)化的目的基因是否在受體植物細胞組織中得到表達，給轉(zhuǎn)化細胞帶上一種標記，起報告和識別作用，故稱報告基因。 理想的植物報告基因應具備以下特征：A.編碼的產(chǎn)物是唯一的，并對宿主植物細胞無毒性B.表達產(chǎn)物及產(chǎn)物的類似功能在未轉(zhuǎn)化的植物細胞 內(nèi)不存在C.產(chǎn)物表達水平穩(wěn)定D.便于檢測第五十七張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月 冠癭堿基因（nos、ocs）Gus基因(-葡糖苷酸酶

34、基因)Cat(氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因)(GFP)綠色熒光蛋白基因第五十八張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月報告基因: Gus基因（-葡萄糖苷酸酶基因） Gus基因是一種報告基因。報告基因系指其編碼產(chǎn)物能夠被快速測定的一類基因，常用來檢測轉(zhuǎn)基因的瞬間表達。 Gus基因來源于細菌，其功能是編碼葡萄糖苷酸酶(glucuronidase，GUS)，該酶能催化許多葡萄糖苷酯類物質(zhì)的水解。絕大多數(shù)的植物細胞內(nèi)不存在內(nèi)源的GUS活性，因而Gus基因被廣泛用作轉(zhuǎn)基因植物的報告基因。用于GUS檢測的常用底物有三種： 5溴4氯3吲哚D葡萄糖苷酸酯(XGluc) 4甲基傘形酮酰D葡萄糖醛酸苷酯(4MUG) 對硝

35、基苯D葡萄糖醛酸苷(PNPG) 第五十九張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月葡萄糖苷酸酶(GUS)檢測上具有以下特點：GUS與X-Gluc底物發(fā)生作用，產(chǎn)生藍色沉淀，既可以用分光光度計法測定，又可以直接觀察到植物組織中形成的藍色斑點。當加入4MUG及PNPG，發(fā)黃色熒光，用熒光光譜法測定（=465nm）。由于熒光強度高，本底低，故熒光檢測極為靈敏。第六十張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月葡萄糖苷酸酶(GUS)檢測上具有以下特點：檢測容易、迅速并能定量，只需少量植物組織抽提液即可在短時間內(nèi)測定完畢。價格便宜。 第六十一張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月GFP（綠色熒光蛋白基因）L

36、UC（螢火蟲熒光素酶基因）報告基因:第六十二張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月三.外源基因整合的分子檢測PCR檢測 利用PCR擴增檢測外源基因整合時，要以被檢組織DNA為模板，以外源基因序列設計引物進行擴增，然后用瓊脂糖凝膠電泳分離擴增產(chǎn)物。若被檢植株基因組DNA中含有外源基因，則可得到擴增產(chǎn)物，瓊脂糖膠上就會出現(xiàn)特異性擴增的條帶。非轉(zhuǎn)化植株基因組DNA中不含有外源基因，則無特異性擴增條帶出現(xiàn)。 注意：PCR擴增可以擴增選擇標記基因，也可擴增目的基因。標記基因的存在并不能完全代表目的基因的存在第六十三張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月 PCR反應包括三個步驟： 變性：在94-95使

37、模板DNA的雙鏈變性成單鏈。 復性：兩個引物分別與單鏈DNA互補復性，復性的溫度在50-60 延伸：在引物的引導及Taq酶的作用下，于72合成模板DNA的互補鏈 這三個步驟稱為一個循環(huán)，PCR反應常有25-35個循環(huán)。 聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR) 是體外快速擴增DNA的方法 第六十四張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月 PCR產(chǎn)物可以通過電泳檢測瓊脂糖電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳第六十五張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月66特異性PCR檢測外源基因整合到受體第六十六張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)基因棉花選擇標記基因NPTII編碼

38、區(qū)段的PCR擴增結果（M為分子量標準，C為非轉(zhuǎn)基因植株，P為質(zhì)粒對照，1-20為轉(zhuǎn)基因植株） 第六十七張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月Southern雜交Northern雜交細胞原位雜交常用的轉(zhuǎn)基因生物分子檢測手段有四、核酸分子雜交技術檢測轉(zhuǎn)基因第六十八張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月轉(zhuǎn)基因植物鑒定所涉及的核酸分子雜交有:Southern雜交是以已知DNA或RNA為探針，檢測目標DNA的存在，用于外源目的基因整合的鑒定及分析。Northern雜交是以已知DNA或RNA為探針，檢測特異的mRNA分子的存在，用于外源目的基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（mRNA）的檢測。細胞原位雜交是一項組織化學與分

39、子雜交相結合的技術，用來檢測組織細胞內(nèi)目標DNA或RNA分子存在位置，采用這一技術可以確定整合有外源基因 的染色體及外源基因在染色體上的位置。另一類似的技術是Western蛋白質(zhì)雜交，它是利用抗原與抗體特異結合的原理檢測外源目的基因表達產(chǎn)物特異蛋白的生成。第六十九張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月70核酸分子雜交技術核酸分子雜交：是指一條單鏈核酸分子（DNA或RNA）通過堿基互補與另一條單鏈核酸分子形成穩(wěn)定雙鏈的過程。 基本原理： 堿基互補、變性和復性 DNA與DNA雜交： A=T、 GC ; DNA與RNA雜交: A=U、 GC ; 變性： 升高溫度至94左右，使核酸雙鏈解開為兩條單鏈

40、； 復性： 緩慢降低溫度（ 52左右），變性的兩條單鏈重新形成 互補雙鏈。 堿基互補:第七十張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月1.Southern雜交(Southern blotting)將DNA用限制性酶酶切酶切DNA電泳變性轉(zhuǎn)移到膜上經(jīng)過標記的DNA探針與膜上的DNA片段雜交洗去膜上非特異性結合的探針檢測雜交信號 。如果轉(zhuǎn)移的膜上具有與雜交探針相同或部分同源的序列，就會檢測到雜交帶信號。 此技術由Southern 1975年首先設計。被檢測對象為DNA。 第七十一張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月帶有DNA片段的凝膠DNA分子限制片段限制性酶切割瓊脂糖電泳至膜（尼龍膜或硝酸纖維素濾膜）上轉(zhuǎn)膜雜交、顯影凝膠濾膜用緩沖液轉(zhuǎn)移DNA吸附有DNA片段的膜Southern 印跡雜交的技術流程第七十二張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月73Southern雜交進行基因診斷第七十三張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月M 1 2 3 4 5 6 7 8 9kb23.1-9.4 -6.6 -4.4 -2.3 -2.0 -轉(zhuǎn)基因棉花的Southern雜交檢測（M為分子量標準，1為陽性對照，2為陰性對照，3-8為轉(zhuǎn)基因植株） 第七十四張，PPT共九十頁，創(chuàng)作于2022年6月75Southern原位雜交（確定外源基因在染色體上的位置）