植物細胞微絲束的光學顯微鏡觀察實驗原理及步驟

1、實驗五：植物細胞微絲束的光學顯微鏡觀察【課前預習】1為什么本實驗中考馬斯亮蘭R250 染的是微絲？2實驗中的各種試劑分別有何作用？【目的要求】掌握植物細胞骨架的光鏡標本制作方法。【基本原理】細胞骨架在通常情況下不穩(wěn)定：如低溫、高壓、餓酸處理等。當用適當濃度的TritonX-100 處理細胞時，能溶解質膜結構中及細胞內許多蛋白質，而細胞骨架系統(tǒng)的蛋白質卻不被破壞顯得更清晰，M-緩沖液洗滌細胞，可以提高細胞骨架的穩(wěn)定性，戊二醛固定能較好地保存細胞骨架成分，經考馬斯亮藍R250 染色后，可使細胞骨架蛋白著色，而胞質背景著色弱，有利細胞骨架纖維顯示。微絲、微管和中間纖維都是直徑很小的結構，最大的單根微

2、管才25nm 左右，只能在電鏡下才能觀察到。目前研究細胞骨架的主要方法是應用高壓電鏡或免疫熒光顯微鏡技術。本實驗用普通光鏡觀察到細胞骨架，是因為骨架纖維成束分布、結構經染色后，有夸大作用。由于細胞經TritonX-100 抽提后剩下的主要是細胞骨架成分，使得顯現(xiàn)更清晰。細胞骨架是指細胞質中縱橫交錯的纖維網(wǎng)絡結構，按組成成分和形態(tài)結構的不同可分為微管、微絲和中間纖維。它們對細胞形態(tài)的維持、細胞的生長、運動、分裂、分化和物質運輸?shù)绕鹬匾饔?。光學顯微鏡下細胞骨架的形態(tài)學觀察多用1% Triton X-100 處理細胞，可使細胞膜溶解，而細胞骨架系統(tǒng)的蛋白質被保存， 再用考馬斯亮蘭R250 染色，使

3、得胞質中細胞骨架得以清晰顯現(xiàn)?！緦嶒炗闷贰?材料：新鮮洋蔥鱗莖2試劑1） M 緩沖液（pH 7.2）各成分終濃度為：50mmol/L 咪唑(MW:68.08)； 50mmol/L KCl(MW:74.55)； 0.5mmol/L MgCl26H2O(MW:203.30)； 1mmol/L EGTA(MW:380.36)；0.1mmol/L EDTA-Na2(MW:372.24)； 1mmol/L DTT(MW:154.3)2） 6mmol/L PBS 磷酸緩沖液 （pH 6.5）：KH2PO4 : Na2HPO4.2H2O = 7:33） 0.7% NaCl 生理鹽水4） 1% Triton

4、X-100(聚乙二醇辛基苯基醚) 溶于 M-緩沖液5） 3% 戊二醛100mL: 25% 戊二醛取12mL，PBS 88mL6） 0.2% 考馬斯亮藍R250 染液 200mL：考馬斯亮藍R250 0.2g；甲醇 46.5mL；冰乙酸 7mL；蒸餾水46.5mL3儀器：光學顯微鏡，鑷子，剪刀，試管，表面皿，滴管，載玻片，蓋玻片【方法步驟】【實驗結果】洋蔥鱗莖外層與內層的表皮細胞比較（放大倍數(shù)1020）洋蔥鱗莖內層的表皮細胞骨架【實驗報告】1光鏡下觀察到的細胞骨架有何形態(tài)特征？2請設計一個實驗鑒定你所觀察到的細胞骨架是哪一類型。附：各種主要試劑的作用1Triton X-100 (聚乙二醇辛基苯基醚)作用：非離子去垢劑；適當濃度的Triton X-100，可使細胞膜溶解，而細胞質中的細胞骨架系統(tǒng)可被保存2M緩沖液和磷酸緩沖液作用：維持細胞的滲透壓3EDTA（乙二胺四乙酸）和EGTA（乙二醇雙醚四乙酸）作用：前者可螯合大部分金屬離子；后者專一性螯合Ca2，主要是高濃度的Ca2可是微管解聚，因此加