氟西汀對海馬神經(jīng)元生長的影響

1、氟西汀對海馬神經(jīng)元生長的影響【關(guān)鍵詞】氟西汀;細胞培養(yǎng);海馬神經(jīng)元;大鼠氟西汀是5-羥色胺5-HT再攝取抑制劑之一，是應(yīng)用較廣的抗抑郁藥。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治療其他中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾玻有研究說明，氟西汀對海馬的神經(jīng)保護作用是其發(fā)揮抗抑郁效應(yīng)的機制之一1。關(guān)于氟西汀對體外培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長的影響未見報道，本研究初步討論了氟西汀對原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元生長的影響。1材料與方法1.1新生大鼠海馬神經(jīng)元的別離和培養(yǎng)技術(shù)方法在參考文獻2根底上加以改良。取出生24h內(nèi)的新生SD大鼠東南大學(xué)醫(yī)學(xué)院動物實驗中心提供，無菌別離出雙側(cè)海馬，用顯微剪剪碎，D-Hanks液清洗2或3次，將剪碎的海馬組織轉(zhuǎn)移至離

2、心管中，參加等量0.25%的胰酶美國Siga公司，37消化30in，中間振搖1或2次，參加10%的DE/F12美國Gib公司5l，輕輕吹打15次，然后1000rin-1離心5in，制成單細胞懸液，置于2培養(yǎng)箱德國Heraeus公司產(chǎn)品中，差速貼壁30in，去除成纖維細胞，汲取未貼壁的細胞，并用200目的不銹鋼濾網(wǎng)過濾，搜集過濾后的單細胞懸液于培養(yǎng)皿中，然后至離心管中，取一滴單細胞懸液進展計數(shù)，并用DE/F12將細胞密度調(diào)到1106l-1，然后接種于200gl-1多聚賴氨酸美國Siga公司包被的6孔培養(yǎng)板中，轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，4h后換為無血清培養(yǎng)基，即含2%B27的Neurbasl培養(yǎng)基美國G

3、ib公司，以后每3天半量換液1次。使用培養(yǎng)6d的神經(jīng)元進展染色鑒定。1.2大鼠海馬神經(jīng)元的鑒定1.2.1烯醇化酶NSE免疫細胞化學(xué)染色取培養(yǎng)6d6孔培養(yǎng)板中的蓋玻片進展神經(jīng)元特異的NSE免疫組織化學(xué)染色。棄去培養(yǎng)液，4%多聚甲醛室溫固定1h，參加0.3%H22甲醇去除內(nèi)源性過氧化氫酶，0.1%TritnX-100破膜，10%綿羊血清封閉，參加一抗1200兔抗鼠NSE抗體，4濕盒過夜，0.01lL-1PBS清洗，參加二抗1200生物素化的山羊抗兔IgG，放入37溫箱孵育60in;0.01lL-1PBS清洗，滴加SAB過氧化物酶復(fù)合物，37溫箱中孵育60in，0.01lL-1PBS清洗，滴加DAB

4、顯色液作用310in，自來水沖洗后，常規(guī)脫水，透明封片。光鏡下觀察NSE表達陽性細胞。1.2.2尼氏染色6孔培養(yǎng)板的細胞培養(yǎng)7d時，取出蓋玻片進展尼氏染色。棄去培養(yǎng)液，0.01lL-1PBS清洗，4%多聚甲醛室溫固定1h，0.01lL-1PBS清洗3次，氯仿中1in，95%、70%乙醇各1in，蒸餾水清洗，置于1%甲苯胺藍染液中染色20in，95%乙醇分化，在顯微鏡下觀察控制，時間以尼氏體顯示明晰為準，37枯燥，二甲苯透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡下觀察。1.3實驗分組在培養(yǎng)的第3天參加氟西汀常州第四制藥廠消費，根據(jù)藥物濃度不同，將實驗細胞分為5組，分別參加1、10、20、40lL-1氟西汀;

5、正常對照組參加等體積的培養(yǎng)基。1.4海馬細胞形態(tài)定量分析倒置相差顯微鏡德國ZEiss公司產(chǎn)品下觀察加藥48h后的海馬神經(jīng)元形態(tài)，每組各孔隨機選擇20個視野每個視野0.172，記錄每個視野內(nèi)細胞長出突起的神經(jīng)元數(shù)目，目鏡測微尺隨機測量15個神經(jīng)元突起的長度和胞體的長徑。1.5統(tǒng)計學(xué)處理應(yīng)用SPSS12.0軟件進展統(tǒng)計分析，各項檢測結(jié)果以x-s表示。多組比擬及組間兩兩比擬采用方差分析。2結(jié)果2.1海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)觀察倒置相差顯微鏡下觀察，培養(yǎng)1d，細胞絕大局部貼壁，細胞形態(tài)大小不一，以單突起的小細胞為主。培養(yǎng)6d，神經(jīng)元胞體較大，突起進一步增多、延長，并形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)圖1。培養(yǎng)12d，神經(jīng)元胞體進

6、一步增大，突起形成比擬稠密的網(wǎng)絡(luò)。培養(yǎng)24d，神經(jīng)元胞體出現(xiàn)空泡，局部神經(jīng)元死亡，胞體崩解，突觸斷裂。2.2海馬神經(jīng)元鑒定NSE免疫細胞化學(xué)染色:染色后光鏡下觀察第6天的神經(jīng)細胞，胞漿和突起被染成棕黃色為NSE抗體表達陽性細胞，以3個視野中陽性神經(jīng)元的數(shù)目占總細胞的比例為神經(jīng)元純度，經(jīng)鑒定神經(jīng)元的純度為90%。見圖2A。2.3氟西汀對海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響結(jié)果見表1和圖3。不同濃度的氟西汀對海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)指標的影響是不同的，10lL-1氟西汀組海馬神經(jīng)元與正常對照組相比，有突起的神經(jīng)元數(shù)目增加、最長突起長度增長P0.05;40lL-1氟西汀組海馬神經(jīng)元與正常對照組相比，有突起神經(jīng)元數(shù)目減少P

7、0.05，最長突起長度及胞體長徑無顯著性差異P0.05;1、20lL-1氟西汀組海馬神經(jīng)元與正常對照組相比，有突起神經(jīng)元數(shù)目、最長突起長度及胞體長徑無顯著性差異P0.05。表1氟西汀對加藥48h海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)的影響略3討論本實驗嚴格控制胰酶的量和消化時間，采用了0.25%胰蛋白酶低濃度溶液、30in長時間消化的方法，盡可能減少別離過程中的化學(xué)損傷。為了防止操作過程中的機械損傷，別離時動作輕柔，規(guī)律換藥，每72h半量換液1次，換液時速度快，以減少對神經(jīng)元生長的影響。本實驗采用了差速貼壁生長，去除了成纖維細胞，并采用B27無血清培養(yǎng)基，可以選擇性地促使神經(jīng)元生長，抑制非神經(jīng)元的生長和繁殖3，從而

8、可以純化海馬神經(jīng)元。NSE是神經(jīng)元分化成熟的特異性標志酶之一，它主要表達于神經(jīng)元的胞體、軸突、樹突局部4，通過NSE免疫細胞化學(xué)染色方法，可以鑒定體外培養(yǎng)的新生大鼠海馬神經(jīng)元及其純度。本實驗通過NSE免疫化學(xué)染色，發(fā)現(xiàn)大局部細胞胞漿和突起被染成棕黃色，計數(shù)陽性細胞百分率為90%。尼氏體是神經(jīng)元的特征性構(gòu)造之一，存在于神經(jīng)元胞體和樹突內(nèi)，可被堿性染料染成深色的顆粒和斑塊，它是細胞內(nèi)的一種蛋白質(zhì)合成裝置，可作為觀察神經(jīng)細胞功能狀態(tài)的靈敏指標。本實驗觀察到培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元胞質(zhì)內(nèi)尼氏體數(shù)量較多，說明培養(yǎng)的海馬神經(jīng)細胞生長良好。NSE免疫細胞化學(xué)染色和尼氏染色結(jié)果提示，本實驗?zāi)芘囵B(yǎng)出純度較高、生長良好的

9、海馬神經(jīng)元。氟西汀不僅是廣泛應(yīng)用的抗抑郁藥，而且可以用于治療癲癇、偏頭痛、認知障礙、焦慮障礙、兒童孤獨癥等諸多神經(jīng)精神疾玻目前研究認為，氟西汀抗抑郁效應(yīng)與它對海馬的神經(jīng)保護作用有關(guān)，這種作用可能是通過促進海馬細胞增殖來抵抗神經(jīng)元的萎縮和喪失來實現(xiàn)的。李鸝等1研究發(fā)現(xiàn)，氟西汀在顯著改善抑郁大鼠抑郁行為的同時，增加了海馬齒狀回神經(jīng)前體細胞的數(shù)目，其增殖也增強，推測促進海馬神經(jīng)元再生可能是氟西汀治療抑郁癥的機制之一。李云峰等5通過慢性應(yīng)激建立小鼠抑郁模型，認為氟西汀促進海馬齒狀回神經(jīng)元再生可能是抗抑郁劑共同作用機制之一，并且可能與進步海馬BDNF程度親密相關(guān)。一些臨床研究的結(jié)果也提示抗抑郁藥具有神經(jīng)

10、保護作用。Santarelli等6研究發(fā)現(xiàn)5-HT再攝取抑制劑能局部逆轉(zhuǎn)認知功能障礙大鼠海馬齒狀回神經(jīng)元增殖減少及樹突萎縮，并能促進海馬神經(jīng)元的再生和存活。Yatte等7通過高分辨率的RI和立體定位方法測定海馬容量，發(fā)現(xiàn)持續(xù)性承受抗抑郁藥物治療與只在發(fā)作時承受治療的患者相比，海馬容量無顯著性降低。本研究首次以體外培養(yǎng)的新生SD大鼠海馬神經(jīng)元為模型，通過細胞形態(tài)定量分析，討論氟西汀對海馬神經(jīng)元生長的影響。hiu等8通過TT方法，發(fā)現(xiàn)濃度在55lL-1以下的氟西汀可明顯促進海馬神經(jīng)干細胞存活，在20lL-1時到達頂峰。根據(jù)hiu等8的研究結(jié)果，本實驗選擇了濃度分別為1、10、20、40lL-1的氟

11、西汀來干預(yù)海馬神經(jīng)元。結(jié)果發(fā)現(xiàn)不同濃度的氟西汀對海馬神經(jīng)元形態(tài)學(xué)指標的影響是不同的，10lL-1氟西汀組海馬神經(jīng)元與正常對照組相比，有突起的神經(jīng)元數(shù)目增加、最長突起長度增長P0.05;40lL-1氟西汀組海馬神經(jīng)元與正常對照組相比，有突起神經(jīng)元數(shù)目減少P0.05，最長突起長度及胞體長徑無顯著性差異P0.05;1、20lL-1氟西汀組海馬神經(jīng)元與正常對照組相比，有突起神經(jīng)元數(shù)目、最長突起長度及胞體長徑無顯著性差異P0.05。結(jié)果說明氟西汀對海馬神經(jīng)元生長的影響有濃度依賴性，濃度過低1lL-1對海馬神經(jīng)元生長的作用不明顯，適當濃度10lL-1可以促進海馬神經(jīng)元的生長發(fā)育，濃度過高40lL-1那么抑

12、制海馬神經(jīng)元的生長。本實驗中氟西汀濃度為40lL-1即出現(xiàn)對海馬神經(jīng)元的抑制作用，與hiu等8研究結(jié)果不完全一致，說明氟西汀對海馬神經(jīng)元和神經(jīng)干細胞的影響存在差異。氟西汀促海馬神經(jīng)元生長的機制尚不明了，有研究9說明，長期給予氟西汀后，大鼠海馬神經(jīng)元的腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子BDNFRNA表達明顯高于對照組，而BDNF具有很強的刺激和促進神經(jīng)細胞生長和分化，維持神經(jīng)細胞存活和正常功能的作用，Divedi等10發(fā)現(xiàn)氟西汀不僅可以增加海馬BDNFRNA的表達，還可以逆轉(zhuǎn)皮質(zhì)酮導(dǎo)致的海馬BDNFRNA表達的降低。據(jù)此可以推測，氟西汀促海馬BDNF表達可能是促海馬神經(jīng)元生長的機制之一。非營養(yǎng)因子家族，包括睫狀

13、神經(jīng)營養(yǎng)因子、膠質(zhì)細胞源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、成纖維細胞生長因子等，都能促進海馬神經(jīng)元的生長，氟西汀是否也可能通過上調(diào)這些因子的表達而促進海馬神經(jīng)元的生長有待研究。本實驗結(jié)果提示，氟西汀可以促進新生大鼠海馬神經(jīng)元的生長，這為氟西汀治療與海馬損害有關(guān)的神經(jīng)精神疾病提供實驗根底和理論根據(jù)。氟西汀促海馬神經(jīng)元生長確實切機制尚待進一步討論?！緟⒖嘉墨I】1李鸝，涂自良，杜士明，等.氟西汀對實驗性抑郁癥大鼠抑郁行為及海馬神經(jīng)元再生的影響J.醫(yī)藥導(dǎo)報，2022，254:280-282.2BreerGJ.IslatinandulturefadultrathippapalneurnsJ.JNeursiethds，19

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15、抗抑郁劑對慢性應(yīng)激小鼠海馬神經(jīng)元再生的影響J.中國藥理學(xué)通報，2022，204:385-388.6SantarelliL，Saxe，Grss，etal.Requireentfhipp-apalneurgenesisfrthebehaviraleffetsfantide-pressantsJ.Siene，2022，3015634:805-809.7YatteI，ShelineD，khtarH，etal.UntreateddepressinandhippapalvluelssJ.AJPsyhiatry，2022，1607:1516-1518.8hiuSH，henSJ，PengH，etal.Fluxetineup-regu-latesexpressinfellularFLIE-inhibitryprtEinandin-hibitsLPS-induedapptsisinhippapus-derivedneuralsteellJ.BiheBiphysResun，2022，3432:391-400.9許珂，張永亮，郁繆宇，等.氟西汀對大鼠海馬腦源性神經(jīng)營養(yǎng)