高壓熱殺菌結(jié)合酸對枯草桿菌芽孢的殺滅作用

1、高壓熱殺菌結(jié)合酸對枯草桿菌芽孢的殺滅作用芽孢通常存在于環(huán)境中，包括食品中，它自身獨(dú)特的結(jié)構(gòu)使其對熱、干燥、紫外線和輻射等處理以及一些殺菌化學(xué)物質(zhì)具有極強(qiáng)的抵抗力1-2，很難被殺滅。由于殺菌強(qiáng)度不夠，芽孢引起的食物腐敗和食物中毒時(shí)有發(fā)生3-4。高壓熱殺菌(high-pressure thermal sterilization，HPTS)作為一種新型的食品殺菌技術(shù)，可以殺滅食品中所有微生物，包括最難殺死的芽孢5，相比于高溫殺菌，HPTS處理過程相對溫和，對食品的感官和營養(yǎng)品質(zhì)的損害較小6-7。近年來，相關(guān)研究致力于HPTS與其他因素相結(jié)合來進(jìn)一步提高芽孢的致死性，例如降低介質(zhì)的pH，TOLA等8報(bào)

2、道：隨著介質(zhì)pH值的降低，HPTS殺滅地衣桿菌芽孢的數(shù)量在增加。ROBERTS等9發(fā)現(xiàn)pH越低，芽孢的抗性減弱，在400 MPa、45 條件下，當(dāng)pH值從7.0降到4.0時(shí)，多殺滅了1.5個(gè)對數(shù)的凝結(jié)桿菌芽孢。然而在高壓熱處理過程中，酸度對芽孢失活的影響以及兩者結(jié)合殺滅芽孢的作用機(jī)理，目前尚不明確。HPTS主要影響芽孢內(nèi)膜的通透性、膜脂的流動性10和芽孢蛋白質(zhì)、核酸的結(jié)構(gòu)11。研究表明，HPTS破壞了芽孢內(nèi)膜對水分子的通透屏障，大量水分子進(jìn)入芽孢內(nèi)核而導(dǎo)致內(nèi)核水合和芽孢死亡12-13，而不同pH值不僅可以改變蛋白質(zhì)、核酸等生物大分子的電荷，還可以改變細(xì)胞膜的電荷，從而影響微生物的功能和活性14

3、。WUYTACK等15研究人員發(fā)現(xiàn)，低pH值會改變氨基酸側(cè)鏈的電離狀態(tài)，從而改變電荷分布和蛋白質(zhì)構(gòu)象。SETLOW等16研究表明酸對芽孢的殺滅涉及芽孢通透性屏障的破壞。傅里葉變換紅外光譜儀目前廣泛應(yīng)用于綜合檢測微生物的生理狀態(tài)17，具有高分辨率、高靈敏度和高效掃描等優(yōu)勢，利用該儀器對芽孢紅外光譜中不同波段進(jìn)行研究，可以分析出HPTS與酸共同作用下芽孢膜脂相態(tài)和蛋白質(zhì)、核酸等物質(zhì)的變化情況。本文將HPTS與酸處理相結(jié)合，對枯草桿菌芽孢進(jìn)行處理，研究HPTS與酸聯(lián)合作用對枯草桿菌芽孢的殺滅效果并探討其殺滅機(jī)理，為深入研究芽孢殺菌抗性及HPTS在殺滅細(xì)菌芽孢上的應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。1 材料與方法1.1

4、 材料與試劑枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，中國普通微生物菌種保藏管理中心(CGMCC)，編號As 1.433；營養(yǎng)瓊脂，天津市大茂化學(xué)試劑廠；促芽孢生長錳鹽營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，向營養(yǎng)瓊脂中加入MnSO4H2O(使Mn2+質(zhì)量濃度為 50 mg/L)，調(diào)pH值，滅菌備用；碘化丙啶(propidium iodide，PI)、TSA-YE培養(yǎng)基，北京索萊寶科技有限公司；鹽酸(分析純)、氫氧化鈉(分析純)，天津市天力化學(xué)試劑有限公司。1.2 儀器與設(shè)備UV-9000S型雙光束紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司；Scientz-1LS真空冷凍干燥干燥濃縮儀，寧波新芝生物科技股份有限

5、公司；Spectrum Two型傅里葉變換紅外光譜儀，美國PerkinElmer公司；CyFlow Cube 8流式細(xì)胞儀，日本SYSMEX(希森美康)株式會社；5L HPP超高壓設(shè)備，包頭科發(fā)高壓科技有限公司1.3 實(shí)驗(yàn)方法1.3.1 枯草桿菌芽孢懸浮液的制備將活化的枯草芽孢桿菌(As 1.433)劃線接種到試管斜面促芽孢生長錳鹽營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37 條件下培養(yǎng)7 d，用無菌去離子水洗滌離心(4 、9 000 r/min、15 min)芽孢3次，芽孢懸浮液濃度大約調(diào)整到1.5109CFU/mL，4 下保存18。實(shí)驗(yàn)前將枯草桿菌芽孢懸浮液濃度調(diào)整到1.5107CFU/mL左右。1.3.2 枯

6、草桿菌芽孢懸浮液的HPTS結(jié)合酸處理通過鹽酸標(biāo)準(zhǔn)液將芽孢懸浮液pH值調(diào)整為1、4、7，各取10 mL芽孢懸浮液于無菌聚乙烯塑料袋中，抽真空封口后置于超高壓設(shè)備腔體中，處理介質(zhì)為水，作為壓力和溫度的傳遞介質(zhì)對芽孢懸浮液加壓升溫。壓力為550 MPa，處理溫度為 25、65、75 ，保壓處理20 min，處理時(shí)間不包括升壓和卸壓所需時(shí)間。壓力水平，時(shí)間和溫度由計(jì)算機(jī)控制。1.3.3 枯草桿菌芽孢平板計(jì)數(shù)方法將處理前后的芽孢懸浮液進(jìn)行梯度稀釋后，在平板中吸取1 mL稀釋液并倒入1520 mL TSA-YE培養(yǎng)基混勻，凝固后在 37 下倒置培養(yǎng)2448 h，計(jì)算菌落總數(shù)對數(shù)值。1.3.4 枯草桿菌芽孢

7、紫外吸收物質(zhì)泄漏量的測定將處理前后的芽孢懸浮液離心(4 、9 000 r/min)15 min，收集上清液，以無菌去離子水為空白參比，使用紫外分光光度計(jì)測定260 nm(核酸)和280 nm(蛋白質(zhì))處的吸光值。1.3.5 流式細(xì)胞儀檢測枯草芽孢桿菌芽孢內(nèi)膜通透性取處理前后的芽孢懸浮液，將菌液濃度稀釋到106107CFU/mL。使用PI染色，在1 mL芽孢懸浮液中加入0.75 L 20 mmol/L的PI染色液，在室溫下暗處孵育15 min。用流式細(xì)胞儀檢測前向散射光、側(cè)向散射光、熒光通道FL2和FL3。采用488 nm激發(fā)光，PI標(biāo)記細(xì)胞在615 nm處發(fā)紅色熒光(FL3)19。數(shù)據(jù)采集后用

8、FSC Express Version 3.0軟件分析。1.3.6 傅里葉變換紅外光譜分析將處理前后的樣品進(jìn)行冷凍干燥，于瑪瑙研缽中磨粉，再與干燥的KBr粉末混合均勻，壓片后置于傅里葉紅外變換光譜儀上，于4 000500 cm-1內(nèi)進(jìn)行掃描，掃描次數(shù)為32次，分辨率為4 cm-1。1.3.7 統(tǒng)計(jì)分析所有實(shí)驗(yàn)至少重復(fù)3次。采用Origin 2022軟件對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析和作圖，以P0.05為顯著差異的標(biāo)準(zhǔn)。2 結(jié)果與分析2.1 HPTS結(jié)合不同pH處理對枯草桿菌芽孢殺滅效果的影響圖1為HPTS結(jié)合不同pH處理后枯草桿菌芽孢存活濃度的變化。由圖1可知，枯草桿菌芽孢處理前的初始計(jì)數(shù)約為1107CF

9、U/mL。常溫常壓下pH=1、pH=4和pH=7單獨(dú)處理后枯草桿菌芽孢的存活濃度分別為6.71、6.77、6.82 lgCFU/mL，與常溫常壓下pH值單獨(dú)處理相比，當(dāng)pH=1時(shí)，550 MPa結(jié)合25 /65 /75 處理后枯草桿菌芽孢的存活濃度為5.62、2.53、0.57 lgCFU/mL；pH=4時(shí)，550 MPa結(jié)合25 /65 /75 處理后枯草桿菌芽孢的存活濃度為6.46、3.6、2.52 lgCFU/mL；pH=7時(shí)，550 MPa結(jié)合25 /65 /75 處理后枯草桿菌芽孢的存活濃度為6.69、3.97、2.59 lgCFU/mL。結(jié)果表明在常溫常壓下pH單獨(dú)處理均無法造成芽

10、孢失活。當(dāng)pH=7時(shí)，550 MPa結(jié)合25 處理對芽孢基本沒有殺滅效果，而pH=1和pH=4時(shí)，550 MPa結(jié)合 25 處理對芽孢有一定的殺滅作用。當(dāng)pH=4和pH=7時(shí)，550 MPa結(jié)合75 處理后芽孢的殺滅效果沒有顯著變化，而pH=1時(shí)，550 MPa結(jié)合75 處理后芽孢存活濃度達(dá)到最低，殺滅效果顯著增強(qiáng)，芽孢最多被殺滅了6.25 lgCFU/mL，這可能是因?yàn)槌邏航Y(jié)合低pH促使芽孢變成脫離子H-芽孢。壓力和熱會增加芽孢對質(zhì)子的通透性，使得在低pH時(shí)芽孢核心部分發(fā)生再水化，說明酸性環(huán)境有利于HPTS殺滅枯草桿菌芽孢15。2.2 HPTS結(jié)合不同pH處理對枯草桿菌芽孢紫外吸收物質(zhì)泄漏

11、量(OD260和OD280)的影響260 nm和280 nm 紫外吸收物質(zhì)的泄漏量常被用來檢測細(xì)胞膜通透性的變化。圖2為HPTS結(jié)合不同pH處理對枯草桿菌芽孢紫外吸收物質(zhì)泄漏量(OD260、OD280)的影響。常溫常壓下，芽孢紫外吸收物質(zhì)泄漏量隨著pH值降低有所增加。經(jīng)HPTS結(jié)合不同pH處理后，芽孢紫外吸收泄漏量增大，說明HPTS結(jié)合不同pH對芽孢的滲透屏障都造成了一定程度的損傷。隨著pH值的降低，550 MPa結(jié)合25 /65 /75 處理后芽孢紫外吸收物質(zhì)泄漏量顯著增加，表明溫度升高到一定程度，酸會進(jìn)一步破壞芽孢的滲透屏障，使得更多的核酸及蛋白質(zhì)類紫外吸收物質(zhì)泄漏出來。圖1 HPTS結(jié)合

12、不同pH處理對枯草桿菌芽孢存活濃度的影響Fig.1 Effect of HPTS combined with different pH treatments onBacillussubtilisspore survival concentration注：圖中不同小寫字母表示組內(nèi)差異顯著(P0.05)圖2 HPTS結(jié)合不同pH處理對枯草桿菌芽孢紫外吸收 物質(zhì)泄漏量的影響Fig.2 Effect of HPTS combined with different pH treatments on the leakage of UV absorbing substances fromBacillussu

13、btilisspores注：不同大寫字母表示OD260值組內(nèi)差異顯著；不同小寫字母 表示OD280值組內(nèi)差異顯著2.3 HPTS結(jié)合不同pH處理對枯草桿菌芽孢細(xì)胞膜損傷的流式細(xì)胞儀檢測流式細(xì)胞儀經(jīng)常被用來檢測細(xì)菌細(xì)胞膜的損傷。圖3分別為HPTS結(jié)合不同pH處理芽孢后的流式細(xì)胞圖，反映芽孢內(nèi)膜通透性的改變20。使用熒光染料PI染色后，在嵌入雙鏈DNA時(shí)會發(fā)出紅色熒光。常溫常壓下，隨著pH值降低，芽孢內(nèi)膜的熒光分布沒有向M2移動，芽孢內(nèi)膜通透性沒有增大，與常溫常壓下pH值單獨(dú)處理相比，當(dāng)pH=1和pH=4時(shí)，550 MPa結(jié)合25 處理后熒光分布基本沒有向M2移動，芽孢損傷程度較小，芽孢內(nèi)膜通透性

14、變化較小，而pH=7時(shí)，550 MPa 結(jié)合25 處理熒光分布明顯向M2移動，芽孢內(nèi)膜通透性增大。隨著溫度上升，HPTS結(jié)合不同pH，熒光分布明顯向M2移動，說明芽孢內(nèi)膜通透性增大，這與紫外吸收泄漏量的結(jié)果相一致。與HPTS單獨(dú)作用相比，HPTS結(jié)合pH=4和pH=7處理后M2比例基本相差不大，而HPTS結(jié)合pH=1處理后M2的比例明顯增大，說明HPTS結(jié)合pH=1與相同條件下HPTS單獨(dú)處理對芽孢內(nèi)膜的破壞作用更強(qiáng)，即可以認(rèn)為HPTS結(jié)合pH=1增強(qiáng)了對芽孢內(nèi)膜的破壞，提高了對芽孢的殺滅效果。2.4 HPTS結(jié)合酸處理前后枯草桿菌芽孢的傅里葉紅外光譜分析圖4為枯草桿菌芽孢在HPTS結(jié)合酸處理

15、前后的傅里葉紅外光譜圖，紅外檢測的波長范圍為4 000500 cm-1，本實(shí)驗(yàn)選取了芽孢殺滅效果最好和內(nèi)膜通透性破壞最嚴(yán)重的條件即pH=1，550 MPa結(jié)合75 進(jìn)行分析，研究HPTS在酸性條件下芽孢內(nèi)膜相態(tài)及化學(xué)組分結(jié)構(gòu)的變化。HPTS結(jié)合酸處理前后的紅外光譜圖的峰形、峰高變化細(xì)微，從而反映出芽孢處理前后的化學(xué)組分基本一致。為了進(jìn)一步探究芽孢紅外光譜中特征波段的變化情況，需要對原紅外光譜圖進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理。二階導(dǎo)數(shù)處理是紅外譜圖分析中常用的方法17，它可以將原紅外譜圖中細(xì)微的差別分辨出來，有利于深入分析原紅外譜圖。圖5-a反映了芽孢內(nèi)膜脂肪酸相變化情況。波數(shù)大約在2 872、2 960 c

16、m-1的譜帶分別表示CH3基團(tuán)對稱和反對稱伸縮振動；波數(shù)約為2 852、2 919 cm-1的譜帶分別表示CH2基團(tuán)對稱和反對稱伸縮振動21，與未處理和HPTS處理的枯草桿菌芽孢相比，HPTS結(jié)合酸處理后，原2 960、2 919 cm-1處的紅外吸收峰發(fā)生了移動，紅外吸收峰強(qiáng)度變化更加劇烈。以上紅外吸收峰反映了芽孢內(nèi)膜的相變化。圖5-a表明，芽孢內(nèi)膜磷脂的不流動性是由于其磷脂處于凝膠態(tài)22，經(jīng)過HPTS結(jié)合酸處理后，芽孢內(nèi)膜的磷脂分子疏水尾鏈混亂度增大，磷脂由凝膠態(tài)變?yōu)橐壕B(tài)，從而流動性增加，最終導(dǎo)致芽孢內(nèi)膜水分子通透屏障的受損。a-pH=1、25 處理；b-pH=4、25 處理；c-pH=

17、7、25 處理；d-pH=1、550 MPa、25 處理；e-pH=4、550 MPa、25 處理； f-pH=7、550 MPa、25 處理；g-pH=1、550 MPa、65 處理；h-pH=4、550 MPa、65 處理；i-pH=7、550 MPa、65 處理； j-pH=1、550 MPa、75 處理；k-pH=4、550 MPa、75 處理；l-pH=7、550 MPa、75 處理圖3 HPTS結(jié)合不同pH處理對枯草芽孢桿菌芽孢內(nèi)膜通透性的影響Fig.3 Effects of HPTS combined with different pH treatments on the mem

18、brane permeability ofBacillussubtilisspores注：M1代表熒光強(qiáng)度較低的陰性區(qū)域；M2代表熒光強(qiáng)度較高的陽性區(qū)域圖4 HPTS結(jié)合酸處理前后枯草桿菌芽孢的紅外光譜圖Fig.4 FT-IR spectra ofBacillussubtilisspores before and after HPTS combined with acid treatment圖5-b反映了芽孢蛋白酰胺帶的蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)變化。從圖5-b中可以看出，HPTS結(jié)合酸處理后，1 674 cm-1處的紅外吸收峰發(fā)生了明顯的變化，從未處理的1 674 cm-1處移動到1 676 cm-1處

19、；1 652 cm-1的紅外吸收峰移動到了1 650 cm-1；1 644 cm-1的紅外吸收峰移動到了1 646 cm-1處，其中1 674 cm-1的吸收峰代表蛋白質(zhì)折疊結(jié)構(gòu)，1 652、1 644 cm-1代表蛋白質(zhì)的螺旋結(jié)構(gòu)23。由此表明，經(jīng)過HPTS結(jié)合酸處理后，紅外吸收峰的位置和峰形均發(fā)生了明顯的變化，芽孢蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)遭到破壞，蛋白質(zhì)發(fā)生了變性。原因可能是酸改變了芽孢內(nèi)膜的電荷，影響其正常生理功能，同時(shí)，酸性條件改變了氨基酸分子側(cè)鏈的電離狀態(tài)，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)構(gòu)象的改變15，在高壓和溫度作用下，芽孢蛋白質(zhì)更容易發(fā)生變性。圖5-c反映了芽孢核酸骨架振動變化。波數(shù)大約在1 080、1

20、 220 cm-1的譜帶分別表示PO基團(tuán)對稱與反對稱伸縮振動17，與未處理和HPTS處理的芽孢相比，HPTS結(jié)合酸處理后，以上2處紅外吸收峰位置向低波數(shù)遷移，吸收峰強(qiáng)度減弱。這是因?yàn)镠PTS結(jié)合酸處理后，進(jìn)一步加劇了芽孢內(nèi)核酸物質(zhì)的變性，核酸分子內(nèi)的氫鍵減弱使得峰位向低波數(shù)遷移。此外，1 200900 cm-1波段主要表示COC伸縮振動，可以反映處理前后細(xì)胞壁肽聚糖層結(jié)構(gòu)的變化24。從圖5-c中可以發(fā)現(xiàn)，芽孢在HPTS處理后肽聚糖層和細(xì)胞壁已經(jīng)明顯改變，結(jié)合酸處理后的變化更加強(qiáng)烈(1 015 cm-1)。芽孢皮層肽聚糖支架是其耐壓特性的關(guān)鍵結(jié)構(gòu)，在萌發(fā)后形成細(xì)胞壁25。芽孢皮層肽聚糖和細(xì)胞壁結(jié)

21、構(gòu)的改變可能使芽孢皮層破裂，從而導(dǎo)致芽孢死亡。a-3 0002 800 cm-1波段；b-1 7001 600 cm-1波段；c-1 300900 cm-1波段圖5 HPTS結(jié)合酸處理前后枯草桿菌芽孢的二階導(dǎo)數(shù)紅外光譜圖Fig.5 Second-derivative infrared spectra ofBacillussubtilisspores before and after HPTS combined with acid treatment3 結(jié)論(1)將芽孢懸浮液的pH值調(diào)整為1、4、7，于550 MPa 結(jié)合25、65、75 處理20 min，平板計(jì)數(shù)結(jié)果表明，常溫常壓下pH值單獨(dú)處理均無法造成芽孢失活。當(dāng)HPTS結(jié)合不同pH處理后，隨著pH值降低，芽孢的殺滅效果明顯增強(qiáng)，當(dāng)