基因敲除細(xì)胞系技術(shù)

1、細(xì)胞系是由具有無限分裂能力的轉(zhuǎn)化細(xì)胞群組成。這通常來源于實(shí)驗(yàn)室患者或動(dòng) 物的細(xì)胞系的致瘤起因。細(xì)胞系在研究中可能是無價(jià)的，整個(gè)醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都異常的 重視。它們通常堅(jiān)固并且需要相對(duì)簡單的條件，從而進(jìn)行組織培養(yǎng)。通過這種方 式，這些類型的細(xì)胞最適合用于概念驗(yàn)證工作的基因敲除細(xì)胞系技術(shù)（例如生物 打印設(shè)備和技術(shù)的開發(fā)和初始實(shí)施）。但是，盡管細(xì)胞系確實(shí)保留了其來源細(xì)胞 類型的某些正常功能，但通常會(huì)大大降低其功能。含有谷氨酰胺合成酶（GS）基因敲除的細(xì)胞系和使用該基因敲除的HEK293細(xì)胞 系生產(chǎn)靶蛋白的方法本發(fā)明涉及從轉(zhuǎn)基因HEK293 （人胚腎293）細(xì)胞系中敲除的新型GS（谷氨酰胺 合成酶）基因和使用

2、該轉(zhuǎn)基因HEK293細(xì)胞系制備靶蛋白的方法。特別地，本發(fā) 明人消除了 HEK293細(xì)胞中GS的表達(dá)，以克服由GS的過表達(dá)引起的細(xì)胞系選擇 障礙，從而通過GS / MSX系統(tǒng)產(chǎn)生靶蛋白，從而提高了效率。因此，高產(chǎn)量靶 蛋白的細(xì)胞系選擇將增加，因此所選細(xì)胞系的蛋白產(chǎn)量顯上升，這表明穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞 系的基因編輯技術(shù)可以有效地用于生產(chǎn)靶蛋白。轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系網(wǎng)狀細(xì)胞可以剖析宿主瘧疾入侵的需求這種無核細(xì)胞的遺傳難治性阻礙了對(duì)宿主紅細(xì)胞蛋白在瘧疾感染中的作用進(jìn)行 了研究。而在研究人員的報(bào)告中，從體外分離出的永生紅細(xì)胞系（BEL-A）分化 出的網(wǎng)狀細(xì)胞支持惡性瘧原蟲的成功入侵和細(xì)胞內(nèi)發(fā)育。利用CRISPR介導(dǎo)的基 因

3、敲除和隨后的互補(bǔ)作用，研究人員驗(yàn)證了紅細(xì)胞受體西那平在惡性瘧原蟲侵襲 中起到的重要作用，并通過受體的重新表達(dá)證明了對(duì)侵襲性細(xì)胞系基因編輯進(jìn)行 挽救。網(wǎng)織紅細(xì)胞的成功侵襲補(bǔ)充了截短的突變體，消除了侵襲過程中basigin 胞質(zhì)域的功能作用。相反，據(jù)報(bào)道，參與侵襲并與basigin相互作用的親環(huán)蛋白B 的敲除不影響網(wǎng)織細(xì)胞的侵襲敏感性。這些數(shù)據(jù)建立了永生紅細(xì)胞來源的網(wǎng)織紅 細(xì)胞作為強(qiáng)大的模型系統(tǒng)的用途，以探索有關(guān)惡性瘧原蟲入侵的宿主受體需求的 假設(shè)。研究人員表明，來自永生紅細(xì)胞的網(wǎng)狀細(xì)胞支持惡性瘧原蟲的侵襲和發(fā)展， 并使用CRISPR介導(dǎo)的基因敲除和侵襲受體的互補(bǔ)來證明該模型系統(tǒng)在瘧疾侵襲 研究中

4、的實(shí)用性。EndoC pH1細(xì)胞系中的CRISPR/Cas9基因組編輯管道，用于研究與細(xì)胞功能有關(guān) 的基因2型糖尿?。═2D）是全球性的大流行病，具有很強(qiáng)的遺傳成分，但是影響疾病 風(fēng)險(xiǎn)的大多數(shù)致病基因都為未知的?，F(xiàn)在，很清楚，胰島8細(xì)胞是T2D發(fā)病機(jī) 制的中心。迄今為止，用于研究T2D風(fēng)險(xiǎn)基因的體外基因敲除（KO）模型一直 集中在嚙齒動(dòng)物8細(xì)胞上。但是，嚙齒動(dòng)物和人的細(xì)胞系之間存在重要的結(jié)構(gòu)和 功能差異。考慮到這一點(diǎn)，研究人員已經(jīng)開發(fā)出了強(qiáng)大的管道，可以在真實(shí)的人 類細(xì)胞系中（EndoC-8H1）中創(chuàng)建穩(wěn)定的CRISPR/Cas9 KO。KO流程包括雙重慢 病毒sgRNA策略，研究人員針對(duì)三個(gè)

5、基因（INS，IDE，PAM）進(jìn)行了概念驗(yàn)證。 研究人員實(shí)現(xiàn)了所有靶基因mRNA水平的顯著降低和蛋白質(zhì)的完全消耗。使用這 種雙重sgRNA策略，可以從目標(biāo)基因中切割出多達(dá)94 kb的DNA，每個(gè)sgRNA 的編輯效率都超過了 87.5%。脫靶序列沒有特別的敲除和編輯。最重要的是，管 道有不影響細(xì)胞的葡萄糖反應(yīng)性胰島素分泌。有趣的是，使用siRNA介導(dǎo)的敲除 （KD）方法比較NEUROD1和SLC30A8的KO細(xì)胞系表現(xiàn)出表型差異。NEUROD1-KO細(xì)胞不活躍，并顯示出較高的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡標(biāo)記。然而， NEUROD1-KD的促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP和基因表達(dá)譜僅適度升高，增幅為34%, 表明慢

6、性ER應(yīng)激，而沒有細(xì)胞死亡的證據(jù)。另一方面，與siRNA沉默相反， SLC30A8-KO細(xì)胞顯示出K ATP通道基因表達(dá)沒有降低?？傮w而言，這種在人的細(xì) 胞系EndoC-8H1中有效創(chuàng)建穩(wěn)定KO的策略將使人們更好地了解與編輯細(xì)胞功能 異常有關(guān)的基因，與其潛在的功能機(jī)制和T2D發(fā)病原理。由Ubigene開發(fā)的CRISPR-U （基于CRISPR / Cas9技術(shù)）在雙鏈斷裂方面比普通 CRISPR / Cas9更有效，而CRISPR-U可以大大提高同源重組的效率，輕松實(shí)現(xiàn)敲 除（KO），體外和體內(nèi)的點(diǎn)突變PM）和敲入（KI）。借助CRISPR-U，Ubigene 已成功編輯了 100多個(gè)細(xì)胞系上

7、的基因。ReferenceGyun Min Lee, Da Young Yu, Soo Min Noh.Cell line containing a knockout of the glutamine synthetase （GS） gene and a method of producing target proteins using a GS knockout HEK293 cell line.2016.US PatentSatchwell T J, Wright K E, Haydnsmith K L, et al. Genetic manipulation of cell line d

8、erived reticulocytes enables dissection of host malaria invasion requirementsJ. Nature Communications, 2019, 10（1）: 3806-3806.Grotz AK, Abaitua F, Navarro-Guerrero E, Hastoy B, Ebner D, Gloyn AL. A CRISPR/Cas9 genome editing pipeline in the EndoC-0H1 cell line to study genes implicated in beta cell

9、function. Wellcome Open Res. 2020;4:150. Published 2020 Apr 29.doi:10.12688/wellcomeopenres.15447.2.Cell culture and testrng（Cdl testing Teport基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而 且具有多種優(yōu)勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達(dá)系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸 上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時(shí)基因表達(dá)可以快速產(chǎn) 生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因細(xì)胞敲 除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細(xì)胞系，對(duì)GLUL基因組位點(diǎn)進(jìn)行靶向測序，產(chǎn)生 了 EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細(xì)胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達(dá)的機(jī)制。Ubigene根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進(jìn)行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計(jì)方案1：小片段基因敲除方案，gRN