基因敲除細胞系技術(shù)

1、細胞系是由具有無限分裂能力的轉(zhuǎn)化細胞群組成。這通常來源于實驗室患者或動 物的細胞系的致瘤起因。細胞系在研究中可能是無價的，整個醫(yī)學(xué)領(lǐng)域都異常的 重視。它們通常堅固并且需要相對簡單的條件，從而進行組織培養(yǎng)。通過這種方 式，這些類型的細胞最適合用于概念驗證工作的基因敲除細胞系技術(shù)（例如生物 打印設(shè)備和技術(shù)的開發(fā)和初始實施）。但是，盡管細胞系確實保留了其來源細胞 類型的某些正常功能，但通常會大大降低其功能。含有谷氨酰胺合成酶（GS）基因敲除的細胞系和使用該基因敲除的HEK293細胞 系生產(chǎn)靶蛋白的方法本發(fā)明涉及從轉(zhuǎn)基因HEK293 （人胚腎293）細胞系中敲除的新型GS（谷氨酰胺 合成酶）基因和使用

2、該轉(zhuǎn)基因HEK293細胞系制備靶蛋白的方法。特別地，本發(fā) 明人消除了 HEK293細胞中GS的表達，以克服由GS的過表達引起的細胞系選擇 障礙，從而通過GS / MSX系統(tǒng)產(chǎn)生靶蛋白，從而提高了效率。因此，高產(chǎn)量靶 蛋白的細胞系選擇將增加，因此所選細胞系的蛋白產(chǎn)量顯上升，這表明穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞 系的基因編輯技術(shù)可以有效地用于生產(chǎn)靶蛋白。轉(zhuǎn)基因細胞系網(wǎng)狀細胞可以剖析宿主瘧疾入侵的需求這種無核細胞的遺傳難治性阻礙了對宿主紅細胞蛋白在瘧疾感染中的作用進行 了研究。而在研究人員的報告中，從體外分離出的永生紅細胞系（BEL-A）分化 出的網(wǎng)狀細胞支持惡性瘧原蟲的成功入侵和細胞內(nèi)發(fā)育。利用CRISPR介導(dǎo)的基 因

3、敲除和隨后的互補作用，研究人員驗證了紅細胞受體西那平在惡性瘧原蟲侵襲 中起到的重要作用，并通過受體的重新表達證明了對侵襲性細胞系基因編輯進行 挽救。網(wǎng)織紅細胞的成功侵襲補充了截短的突變體，消除了侵襲過程中basigin 胞質(zhì)域的功能作用。相反，據(jù)報道，參與侵襲并與basigin相互作用的親環(huán)蛋白B 的敲除不影響網(wǎng)織細胞的侵襲敏感性。這些數(shù)據(jù)建立了永生紅細胞來源的網(wǎng)織紅 細胞作為強大的模型系統(tǒng)的用途，以探索有關(guān)惡性瘧原蟲入侵的宿主受體需求的 假設(shè)。研究人員表明，來自永生紅細胞的網(wǎng)狀細胞支持惡性瘧原蟲的侵襲和發(fā)展， 并使用CRISPR介導(dǎo)的基因敲除和侵襲受體的互補來證明該模型系統(tǒng)在瘧疾侵襲 研究中

4、的實用性。EndoC pH1細胞系中的CRISPR/Cas9基因組編輯管道，用于研究與細胞功能有關(guān) 的基因2型糖尿?。═2D）是全球性的大流行病，具有很強的遺傳成分，但是影響疾病 風(fēng)險的大多數(shù)致病基因都為未知的?，F(xiàn)在，很清楚，胰島8細胞是T2D發(fā)病機 制的中心。迄今為止，用于研究T2D風(fēng)險基因的體外基因敲除（KO）模型一直 集中在嚙齒動物8細胞上。但是，嚙齒動物和人的細胞系之間存在重要的結(jié)構(gòu)和 功能差異?？紤]到這一點，研究人員已經(jīng)開發(fā)出了強大的管道，可以在真實的人 類細胞系中（EndoC-8H1）中創(chuàng)建穩(wěn)定的CRISPR/Cas9 KO。KO流程包括雙重慢 病毒sgRNA策略，研究人員針對三個

5、基因（INS，IDE，PAM）進行了概念驗證。 研究人員實現(xiàn)了所有靶基因mRNA水平的顯著降低和蛋白質(zhì)的完全消耗。使用這 種雙重sgRNA策略，可以從目標(biāo)基因中切割出多達94 kb的DNA，每個sgRNA 的編輯效率都超過了 87.5%。脫靶序列沒有特別的敲除和編輯。最重要的是，管 道有不影響細胞的葡萄糖反應(yīng)性胰島素分泌。有趣的是，使用siRNA介導(dǎo)的敲除 （KD）方法比較NEUROD1和SLC30A8的KO細胞系表現(xiàn)出表型差異。NEUROD1-KO細胞不活躍，并顯示出較高的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和凋亡標(biāo)記。然而， NEUROD1-KD的促凋亡轉(zhuǎn)錄因子CHOP和基因表達譜僅適度升高，增幅為34%, 表明慢

6、性ER應(yīng)激，而沒有細胞死亡的證據(jù)。另一方面，與siRNA沉默相反， SLC30A8-KO細胞顯示出K ATP通道基因表達沒有降低?？傮w而言，這種在人的細 胞系EndoC-8H1中有效創(chuàng)建穩(wěn)定KO的策略將使人們更好地了解與編輯細胞功能 異常有關(guān)的基因，與其潛在的功能機制和T2D發(fā)病原理。由Ubigene開發(fā)的CRISPR-U （基于CRISPR / Cas9技術(shù)）在雙鏈斷裂方面比普通 CRISPR / Cas9更有效，而CRISPR-U可以大大提高同源重組的效率，輕松實現(xiàn)敲 除（KO），體外和體內(nèi)的點突變PM）和敲入（KI）。借助CRISPR-U，Ubigene 已成功編輯了 100多個細胞系上

7、的基因。ReferenceGyun Min Lee, Da Young Yu, Soo Min Noh.Cell line containing a knockout of the glutamine synthetase （GS） gene and a method of producing target proteins using a GS knockout HEK293 cell line.2016.US PatentSatchwell T J, Wright K E, Haydnsmith K L, et al. Genetic manipulation of cell line d

8、erived reticulocytes enables dissection of host malaria invasion requirementsJ. Nature Communications, 2019, 10（1）: 3806-3806.Grotz AK, Abaitua F, Navarro-Guerrero E, Hastoy B, Ebner D, Gloyn AL. A CRISPR/Cas9 genome editing pipeline in the EndoC-0H1 cell line to study genes implicated in beta cell

9、function. Wellcome Open Res. 2020;4:150. Published 2020 Apr 29.doi:10.12688/wellcomeopenres.15447.2.Cell culture and testrng（Cdl testing Teport基因敲除切割效率不僅可以讓人具有生成蛋白基化譜和建立調(diào)控記錄的能力，而 且具有多種優(yōu)勢，是一種特別有吸引力的重組蛋白表達系統(tǒng)。首先，它在谷氨酸 上羧基化，在酪氨酸上硫酸化。第二，操作簡單，通過瞬時基因表達可以快速產(chǎn) 生重組蛋白。第三，可用于穩(wěn)定的重組蛋白生產(chǎn)。一些研究人員利用基因細胞敲 除切割效率系統(tǒng)產(chǎn)生基因編輯細胞系，對GLUL基因組位點進行靶向測序，產(chǎn)生 了 EPO的穩(wěn)轉(zhuǎn)細胞系，并發(fā)現(xiàn)重組促紅細胞生成素在人體內(nèi)穩(wěn)定表達的機制。Ubigene根據(jù)科研需求，結(jié)合靶基因的情況進行基因穩(wěn)轉(zhuǎn)敲除方案設(shè)計方案1：小片段基因敲除方案，gRN