甘露聚糖酶活力的測定

1、甘露聚糖酶活力的測定、原理甘露聚糖酶能從底物L(fēng)BG（Gum, Locus Bean洋槐豆粉）中水解產(chǎn)生還原糖。還原糖的產(chǎn) 生量與酶活性成正比，用DNS顯色法測定還原糖的含量，從而計(jì)算出酶活力。二、酶活力單位（U）的定義在40C、pH 6.0的酶活力測定條件下，1min催化5mg/mL LBG底物溶液生成1艇還原 糖（以甘露糖表示）所需的酶量定義為一個(gè)酶活力單位U）,其中樣品的酶活力以U/g （固 體酶）或U/mL （液體酶）表示。三、主要儀器3.1紫外可見分光光度計(jì)3.2電子天平：感量0.0001g3.3恒溫水浴鍋3060C可調(diào)，精度為0.1C。3.4 pH計(jì)：精確至0.013.5秒表：每小時(shí)

2、誤差不超過5s。3.6 離心機(jī)：3000-4000g3.7移液器：1-5mL可調(diào)，精度川L。四、試劑與溶液配制除特殊說明外，所用的試劑均為分析純，水均為符合GB/T6682中規(guī)定的二級(jí)水。4.1 0.05M pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液：稱十二水磷酸氫二鈉（Na2HPO4 12H2O） 45.23g，檸檬酸8.07g，溶于900mL蒸餾水 中，用0.2M NaOH溶液或0.2M HCL溶液調(diào)至pH6.0，加蒸餾水定容至1.0L，混勻。4.2氫氧化鈉溶液（200g/L）：稱取氫氧化鈉20.0g，加水溶解，定容至100mL。DNS 試劑：稱取3,5-二硝基水楊酸3.15g （化學(xué)純），加水5

3、00mL，攪拌5s，水浴至45C。然后逐 步加入100mL氫氧化鈉溶液（4.2），同時(shí)不斷攪拌，直到溶液清澈透明（注意：在加入氫 氧化鈉過程中，溶液溫度不要超過48C）。再逐步加入四水酒石酸鉀鈉91.0g、苯酚2.50g 和無水亞硫酸鈉2.50g。繼續(xù)45C水浴加熱，同時(shí)補(bǔ)加水300mL，不斷攪拌，直到加入的物 質(zhì)完全溶解。停止加熱，冷卻至室溫后，用水定容至1000mL。用燒結(jié)玻璃過濾器過濾。取 濾液，儲(chǔ)存在棕色瓶中，避光保存。室溫下存放7天后可以使用，有效期為6個(gè)月。LBG （洋槐豆粉）底物溶液，濃度10mg/mL：準(zhǔn)確稱取1.00gLBG （洋槐豆粉，Sigma G0753），徐徐加入90

4、mL 0.05M pH6.0磷酸氫二 鈉-檸檬酸緩沖液（4.1）中，磁力攪拌緩慢加熱，直至LBG完全溶解。然后停止加熱，繼 續(xù)攪拌30min。冷卻后，用0.05M pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（4.1）定容至100mL， LBG底物溶液能立即使用，使用前適當(dāng)搖勻。此溶液標(biāo)記為10mg/mL LBG底物溶液pH6.0， 4C避光保存，有效期為3天。10mg/mL甘露糖標(biāo)準(zhǔn)液稱取無水甘露糖1.000g （應(yīng)在105C烘至恒重的，一般2h），用pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬 酸緩沖液（4.1）溶液，定容于100mL。五、標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作分別吸取 10mg/mL 甘露糖標(biāo)準(zhǔn)液（4.5）0，1.0，2.

5、0，3.0，4.0，5.0，6.0mL 于 100mL 容量瓶中，用pH 6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（4.1）稀釋至刻度，得到0，100，200，300， 400，500，600gg/mL的標(biāo)準(zhǔn)稀釋液。取不同濃度稀釋液各2mL于試管中，加2mL pH6.0磷 酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（4.1），DNS試劑（4.3） 5mL，于沸水浴沸騰5min （樣品放入從新 沸騰計(jì)時(shí)），取出后立即用自來水冷卻至室溫，并加入蒸餾水定容至25mL，混勻，以不含 甘露糖的為空白，在540nm處分別測定其吸光度OD值，記錄OD值。以吸光度OD值為橫坐標(biāo)，以相應(yīng)甘露糖濃度為縱坐標(biāo)，繪制出標(biāo)準(zhǔn)曲線或作回歸方程 （R2

6、值要大于0.998才能使用，否則應(yīng)重做）。每次新配制DNS試劑均需要重新繪制標(biāo)準(zhǔn)曲 線。六、測定步驟6.1待測酶液的制備固體酶樣：準(zhǔn)確稱取1g樣品（微丸酶應(yīng)先粉碎），精確至0.0001g置于100mL容量瓶 中，加入約70mL 0.05M pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（4.1），在磁力攪拌器上高速攪拌 20min（這很重要，抽提時(shí)間不足對(duì)酶活影響很大），用0.05MpH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖 液（4.1）定容至刻度（減去磁力攪拌棒的體積），搖勻，在離心機(jī)上以4000r/min離心10min， 取1.0mL上清液用0.05M pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（4.1）作適當(dāng)稀釋（吸

7、光度OD 值在0.2-0.4之間），等待反應(yīng)。液體酶樣：吸取5mL液體酶在離心機(jī)上以4000r/min離心10min，取1.0mL上清液用 0.05M pH6.0磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（4.1）定容至100mL作為待測酶液（用前作適當(dāng)稀 釋；吸光度OD值在0.2-0.4之間），等待反應(yīng)。6.2 測定6.2.1 吸取 10.0mL 10mg/mL LBG底物溶液（4.4），40C平衡 10min。吸取10.0mL經(jīng)過適當(dāng)稀釋的待測酶液，40C平衡10min。6.2.2酶空白樣的制備吸取2.00mL經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液（已經(jīng)過40C平衡），加入到刻度試管中，再加入5mL DNS試劑（4.3），振蕩

8、3s。然后加入2.0mL LBG底物溶液（4.4），40C保溫20min，沸水浴加熱5min。用自來水冷卻至室溫，加水定容至25mL，振蕩3s。以此作為下步反應(yīng) 空白調(diào)零樣。6.2.3酶反應(yīng)樣吸取2.00mL經(jīng)過適當(dāng)稀釋的酶液（已經(jīng)過40C平衡），加入到刻度試管中，再加入2.0mL LBG底物溶液（4.4）（已經(jīng)過40C平衡），振蕩3s，40C精確保溫20min。加入5.0mLDNS試劑（4.3），振蕩3s，以終止酶解反應(yīng)。沸水浴加熱5min，用自來水冷卻至室溫，加水定容至25mL，混勻。以酶空白樣（6.2.2）為空白調(diào)零，在540nm出測定吸光度OD值。 需做2個(gè)平行。查標(biāo)準(zhǔn)曲線或回歸方程式，求出樣品中還原糖量。OD值以在0.2-0.40范圍為宜，若不 在此范圍需改變稀釋倍數(shù)后再做。七、結(jié)果表示與計(jì)算按式（1）(1)