體外轉(zhuǎn)錄制備DNA模板

1、體外轉(zhuǎn)錄制備DNA模板，體外轉(zhuǎn)錄一、體外轉(zhuǎn)錄制備DNA模板具有平末端或5-突出末端的雙鏈線性DNA可作為體外轉(zhuǎn)錄模板。線性化的質(zhì)粒 DNA、PCR產(chǎn)物或cDNA只要含有雙鏈RNA聚合酶啟動(dòng)子且方向正確均可用作轉(zhuǎn)錄模板。1、不同RNA聚合酶的同源啟動(dòng)子序列：T7:TAATACGACTCACTATA(+1)GGGT3:AATTAACCCTCACTAAA(+1)GGGSP6:ATTTAGGTGACACTATA(+1)GAAG(+1)是RNA轉(zhuǎn)錄的起始位點(diǎn)正義還是反義RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的合成依賴于啟動(dòng)子的方向 (相對(duì)于目標(biāo)序列)。正義RNA合成要求目標(biāo)序列置于啟動(dòng)子的下游，而反義RNA的合成 則恰好相反。

2、2、質(zhì)粒模板質(zhì)量：質(zhì)粒DNA的質(zhì)量影響轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量和合成RNA的完整性。最高純度的質(zhì)粒模板 可獲最大的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)量。常規(guī)實(shí)驗(yàn)方法純化的DNA如果沒有RNases、SDS、EDTA、蛋白 質(zhì)、鹽類*和RNA污染即可用作轉(zhuǎn)錄的模板。轉(zhuǎn)錄用DNA模板A260/280比值應(yīng)在1.8- 2.0 之間。 GeneJETPlasmidMiniprepKit(#K0502) 可制備高純度的轉(zhuǎn)錄用 DNA。*當(dāng)NaCl或KCl的濃度超過150mM時(shí)，T7和SP6RNA聚合酶的活性50%被抑 制；當(dāng)NaCl或KCl的濃度超過250mM時(shí)，T3RNA聚合酶的活性50%被抑制。線性化：如需獲得特定長(zhǎng)度的RNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，可在插

3、入位點(diǎn)下游選擇合適的限制酶 (切割產(chǎn)生平末端或5-突出末端為佳)切割質(zhì)粒DNA使之線性化。有報(bào)道指出3-突出末端 可能會(huì)引起錯(cuò)誤轉(zhuǎn)錄(1),應(yīng)盡量避免。3-突出末端可在轉(zhuǎn)錄前經(jīng)T4DNA聚合(#EP0061) 處理平端化。抽提：由于RNA聚合酶具有很高的持續(xù)合成能力，環(huán)狀質(zhì)粒模板轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生不同種類 長(zhǎng)片段RNA轉(zhuǎn)錄子的產(chǎn)量比線性質(zhì)粒模板高。因此質(zhì)粒徹底線性化對(duì)確保有效合成特定長(zhǎng) 度轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物非常重要。如果不能徹底酶切，轉(zhuǎn)錄前可考慮凝膠回收（如 DNAGelExtraction Kit（#K0513）線性化DNA。線性化后，推薦酚/氯仿抽提純化DNA模板：（1）加入1/10體積3M醋酸鈉溶液（#R1

4、181）到DNA溶液中。（ 2）徹底混勻。（3）加入等體積酚/氯仿混合物（1:1 比例）抽提后再用等體積氯仿抽提兩次。收集水相轉(zhuǎn)移 至新離心管。（4）加入2倍體積乙醇沉淀DNA, -20C靜置至少30分鐘，離心收集沉淀。（5）棄上清，加入500170%冰乙醇漂洗沉淀。（6）加入 20|i1DEPC 處理水（#R0601）重懸 DNA。3、PCR模板：PCR產(chǎn)物可作為體外轉(zhuǎn)錄模板。RNA聚合酶啟動(dòng)子要求定位在待轉(zhuǎn)錄序列 的上游。二、常規(guī)體外轉(zhuǎn)錄采用以下操作方法可從lgDNA模板中制備10gRNA轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物。反應(yīng)體系可以放大 或縮小。如需高產(chǎn)量轉(zhuǎn)錄制備多達(dá)200昭 的RNA轉(zhuǎn)錄子，請(qǐng)選用Transc

5、riptAidT7High Yie1dTranscriptionKit（#K0441） 。解凍凍存的試劑，混勻后短暫離心。酶蛋白和核苷酸需冰上放置。反應(yīng)緩沖液需室溫放置。1、室溫配制以下反應(yīng)體系：ATP/GTP/CTP/UTPMix,10mMeach10|il(終濃度 2mM)線性化模板 DNA11gRiboLockRNaseInhibitor 1.2511(50u)T7 或 T3 或 SP6RNAPo1ymerase1.511(30u)DEPC 處理水 (#R0601)至 5011總體積 50112、37C孵育2小時(shí)。3、可選：加入 2M(2u)DNaseI,RNase -free(#EN0521)，混勻后 37C 孵育 15 分