分子標(biāo)記技術(shù)20091課件

1、分子標(biāo)記技術(shù)Molecular Marker Technology 分子標(biāo)記技術(shù)課程安排一、分子標(biāo)記技術(shù)概述 (3)二、DNA的提取、PCR優(yōu)化與克隆 (3)三、顯性分子標(biāo)記技術(shù) (ISSR、AFLP) (6)四、共顯性分子標(biāo)記技術(shù)(RFLP、SSR) (6)五、分子標(biāo)記數(shù)據(jù)的讀取方法與分析 (3)六、序列測定與分析 (3)文獻(xiàn)討論 (6-12) 周延清(編著). 2005. DNA分子標(biāo)記技術(shù)在植物研究中的應(yīng)用. 北京：化學(xué)工業(yè)出版社 鄭成木主編. 2003. 植物分子標(biāo)記原理與方法. 長沙：湖南科學(xué)技術(shù)出版社 鄒喻蘋,葛頌,王曉東等.2001.系統(tǒng)與進(jìn)化植物學(xué)中的分子標(biāo)記.北京:科學(xué)出版社

2、 Caetano-Anolles G & Gresshoff P M (eds) . 1998. DNA Markers: Protocols, Applications, and Overviews. New York: Wiley-Vch Press. 王中仁. 1996. 植物等位酶分析. 北京：科學(xué)出版社參 考 資 料一、分子標(biāo)記技術(shù)概述形態(tài)標(biāo)記Color: yellow vs white etcTexture: smooth vs rough etcShape: round vs irregular etc 遺傳標(biāo)記原用于遺傳作圖，確定染色體上基因順序（gene mapping） 1

3、913年，Alfred H. Sturtevant 使用六個(gè)形態(tài)標(biāo)記構(gòu)建了第一個(gè)果蠅遺傳圖譜 1923年，Karl Sex發(fā)現(xiàn)菜豆數(shù)量性狀（種子顏色和大?。┖蛿?shù)量性狀位點(diǎn)之間的遺傳連鎖 （QTL）細(xì)胞學(xué)標(biāo)記核型分析 (karyotype analysis)染色體顯帶 (chromosome banding) 分子標(biāo)記 或蛋白質(zhì)序列（大小）(狹義的) 指基于DNA分子序列的標(biāo)記(廣義的) 指可遺傳的、且可檢測到的DNA序列是以生物大分子的多態(tài)性為基礎(chǔ)的一種遺傳標(biāo)記 分子標(biāo)記是能反映生物個(gè)體或種群間基因組中某些差異特征的DNA片段 分子標(biāo)記（molecular marker）技術(shù)產(chǎn)生的原因：（形態(tài)

4、性狀的局限） 基于形態(tài)的遺傳標(biāo)記（形態(tài)標(biāo)記）發(fā)展到同工酶又到DNA分子標(biāo)記 DNA分子標(biāo)記在分子生物學(xué)的發(fā)展過程中誕生和發(fā)展，它能夠直接反映基因組DNA間的差異* DNA或cDNA等分子水平上的多態(tài)性檢測技術(shù)* 能提供分子標(biāo)記的分子生物學(xué)技術(shù)分子標(biāo)記技術(shù)First Generation: 1980s -Based on DNA-DNA hybridizations, such as RFLP.Second Generation: 1990s -Based on PCR: Using random primers: RAPD, DAF, ISSR. Using specific primers:

5、 SSR, SCAR, STS -Based on PCR and restriction cutting: AFLP, CAPs.Third Generation: recently -Based on DNA point mutations (SNP), can be detected by SSCP, DNA chip, sequencing etc.酶切擴(kuò)增多態(tài)性序列（Cleaved Amplified Polymorphic Sequence，CAP）Molecular Markers Classes 1974年，Grozdicker等人首創(chuàng)了DNA分子標(biāo)記，即第一代DNA分子標(biāo)記：

6、限制性片段長度多態(tài)性標(biāo)記 （RFLP） 1982年，Hamande發(fā)現(xiàn)了第二代DNA分子標(biāo)記：簡單序列重復(fù)標(biāo)記（SSR） 1990年，Williams和Welsh等發(fā)現(xiàn)了隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA標(biāo)記（RAPD） 1993年，Zebeau和Vos發(fā)明了擴(kuò)增片段長度多態(tài)性標(biāo)記（AFLP） 1994年，Zeitkiewicz等等發(fā)明了簡單重復(fù)見序列標(biāo)簽（ISSR） 1998年，第三代DNA分子標(biāo)記SNP誕生 隨后，大量的分子標(biāo)記技術(shù)被發(fā)展了起來宏觀微觀個(gè)體居群生物群落組織細(xì)胞分子生態(tài)系統(tǒng)器官分子標(biāo)記的特點(diǎn)對(duì)理想的遺傳標(biāo)記的要求：具有高的多態(tài)性 共顯性遺傳（鑒別二倍體中雜合和純合基因型）能夠明確辨別等位基

7、因 分布于整個(gè)基因組中 選擇中性（即無基因多效性） 檢測手段簡單快速（如實(shí)驗(yàn)程序易自動(dòng)化） 開發(fā)成本和使用成本盡量低廉 在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)和實(shí)驗(yàn)室間重復(fù)性好（便于數(shù)據(jù)交換） DNA分子標(biāo)記大多以電泳譜帶的形式表現(xiàn) 基于DNA分子標(biāo)記的分子標(biāo)記技術(shù)大致可分為五大類分子標(biāo)記技術(shù)的類型1）以Southern雜交為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù) 限制性內(nèi)切酶片斷長度多態(tài)性標(biāo)記（restriction fragment length polymorphism, RFLP） 單鏈構(gòu)象多態(tài)性RFLP（sing strand conformation polymorphism-RFLP, SSCP-RFLP） 變性梯度凝膠電泳R

8、FLP（denaturing gradient gel electrophoresis-RFLP，DDGCE-RFLP） 原位雜交（in situ hybridization）2）以PCR為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（randomly amplified polymorphic DNA, RAPD） 序列標(biāo)記位點(diǎn)（sequence tagged site, STS） 序列特征化擴(kuò)增區(qū)域（sequence characterized amplified region, SCAR）技術(shù) 隨機(jī)引物PCR（random primer-PCR, RP-PCR） 任意引物PCR（arbitrar

9、y primer-PCR, AP-PCR） 寡核苷酸引物PCR（oligo primer-PCR, OP-PCR） 單鏈構(gòu)象多態(tài)性PCR（single strand conformation polymorphism-PCR, SSCP-PCR）什么是STSs：即序列位置標(biāo)簽（Sequence Tagged Site）是指一小段DNA片段（200500個(gè)堿基對(duì)），它的精確位置和堿基順序已經(jīng)明確的。由于每個(gè)STS都是唯一的，一對(duì)唯一的PCR引物對(duì)應(yīng)一個(gè)STS，通過PCR反應(yīng)中也可以檢測出STS來，STS適宜于作為人類基因組的一種地標(biāo)，據(jù)此可以判定DNA的方向和特定序列的相對(duì)位置。ETS是cDNA

10、上的STS。NCBI建有STS數(shù)據(jù)庫，既可以查詢STS,也可以提交，url: /dbSTS/index.htmlDefinition in English: Short tagged tracts of DNA sequence (200 to 500 base pairs) that is operationally unique and has a single occurrence in the human genome. Their location and base sequence are known and therefore they can be used as landma

11、rks in genome mapping. They can be detected by the polymerase chain reaction in the presence of all other genomic sequences). Sequence-tagged sites are useful for mapping the sequence data reported from different laboratories and provide a framework for the physical map of the human genome. The over

12、whelming advantage of sequence-tagged sites over mapping landmarks defined through other methods is that the method can be completely described as information in a database. Expressed sequence tags are sequence tagged sites derived from cDNAs. 網(wǎng)絡(luò)資料 小寡核苷酸DNA分析（small oligo DNA analysis, SODA） DNA擴(kuò)增指紋技

13、術(shù)（DNA amplification fingerprinting, DAF） 擴(kuò)增片斷長度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism, AFLP） 相關(guān)序列擴(kuò)增多態(tài)性（sequence-related amplified polymorphism, SRAP） 靶位區(qū)域擴(kuò)增多態(tài)性（target region amplified polymorphism, TRAP） 插入/缺失多態(tài)性（insertion/deletion polymorphism, InDel 或I/D）RAPD 原理示意圖DNA提取選擇隨機(jī)引物PCR反應(yīng)凝膠電泳圖譜分析RAPDA

14、FLPGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAGAPCRABCSSRISSR（inter-simple sequence repeat）-CACACACACACACACACACACA-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-CACACACACACACACACACACACACACACACACA-5錨定引物5錨定引物NNNN(CA)nNNNN(CA)nNN(CA)nNN(CA)n3錨定引物3錨定引物-3錨定引物的PCR產(chǎn)物CACACACACACACACA-GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT

15、GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGT-CACACACACACACACACACACACACACA5錨定引物的PCR產(chǎn)物簡單重復(fù)序列間區(qū)cDNA 文庫ESTRACE公共數(shù)據(jù)庫全長cDNA克隆電腦克隆基因表達(dá)譜分析5）以 單核苷酸多態(tài)性為基礎(chǔ)的分子標(biāo)記技術(shù) 單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP） 主要是指在基因組水平上由單個(gè)核苷酸的變異所引起的DNA序列多態(tài)性。 DNA分子標(biāo)記多態(tài)性的產(chǎn)生有其分子的基礎(chǔ) 生物個(gè)體在DNA水平上的差異（或多態(tài)）是DNA分子標(biāo)記能進(jìn)行檢測和分析的基礎(chǔ) DNA分子標(biāo)記多態(tài)性的原理Point Mutation at

16、restriction sites (RFLP, CAPS, AFLP) or PCR primer sites (RAPD, DAF, AP-PCR, SSR, ISSR)B. Insertion or deletion between restriction sites (RFLP, CAPS, AFLP) or PCR primer sites (RAPD, DAF, AP-PCR, SSR, ISSR)C. Changes in the number of repeat unit between restriction sites or PCR primer sites: SSR, V

17、NTR, ISSRD. Mutations at single nucleotides: SNPPolymorphism of DNA Markers根據(jù)DNA標(biāo)記產(chǎn)生的方式也可以對(duì)所有標(biāo)記進(jìn)行簡單的歸類：Comparison among genetic markersDNA分子標(biāo)記技術(shù)具有諸多優(yōu)點(diǎn)廣泛應(yīng)用： 植物分子遺傳圖譜的構(gòu)建 植物遺傳多樣性分析與種質(zhì)鑒定 重要的農(nóng)藝性狀基因定位與圖位克隆 轉(zhuǎn)基因植物鑒定和分子標(biāo)記輔助選擇育種 取得驚人的成績，具有廣闊的應(yīng)用前景成 績 考 核精讀1或多篇用分子標(biāo)記技術(shù)探索某一科學(xué)問題的有影響的文章，寫一篇評(píng)述。題目自擬，制成A3正反面海報(bào)(相當(dāng)于A4紙， 4頁), 字號(hào)自定。內(nèi)容包括：作者（如Fritsch et al.)、年份、文章標(biāo)題，期刊、卷、起止頁碼摘要研究背景 （1）相關(guān)研究進(jìn)展 （2）科學(xué)問題是什么？研究方法 使用何種分子標(biāo)記技術(shù)？是否結(jié)合其他方法？研究結(jié)果與分析 簡明扼要，文字以5段左右為宜，要求能說明問題的