影響植物離體快速繁殖遺傳穩(wěn)定性的因素及提高遺傳穩(wěn)定性的措施

1、影響植物離體，快速繁殖遺傳穩(wěn)定性的因素及提高遺傳穩(wěn)定性的措施所謂快速繁殖，就是將外植體在人工培養(yǎng)基和合適的條件下進(jìn) 行培養(yǎng)，以在短期內(nèi)獲得大量遺傳性一致的個(gè)體的方法。其特點(diǎn)是： 繁殖速度快；使用材料少，生產(chǎn)效率高，省時(shí)省工；可大量繁殖脫毒 苗；利于種質(zhì)資源的保存和交換等；節(jié)約空間，不受季節(jié)限制，有利 于植物的工廠化生產(chǎn)；在無菌條件下進(jìn)行，不受病蟲害侵害?？焖俜?殖過程一般包括四個(gè)階段，即無菌培養(yǎng)物的建立、芽的增殖、誘導(dǎo)生 根和試管苗的馴化和移載。影響遺傳穩(wěn)定性的因素：首先是基因型，有些植物通過組培培 養(yǎng)不容易發(fā)生遺傳性的變異，有些植物則很容易發(fā)生變異，這是由于 植物的基因型不同造成的。單倍體和

2、多倍體比二倍體容易發(fā)生變異。 其次是繼代次數(shù)，試管苗繼代次數(shù)直接影響遺傳的穩(wěn)定性。繼代次數(shù) 越多，變異比例越高。最后是植物再生方式，植物再生有不同的方式， 其遺傳穩(wěn)定性也有很大差異，一般用腋芽萌發(fā)方式的增殖體基本沒有 變異。從試管苗上形成不定芽來增殖的方式，一般也不發(fā)生變異。但 通過愈傷組織再分化出的不定芽形成的植株中變異率較高。由體細(xì)胞 直接誘導(dǎo)出胚狀體和原球莖，一般變異也較少，而從愈傷組織再分化 出的胚狀體形成的株中變異較多。第一，外植體基因型對組織培養(yǎng)物遺傳穩(wěn)定性的影響。植株基 因型培養(yǎng)時(shí)間并不是影響植株遺傳穩(wěn)定性的惟一參數(shù)，基因型對植 物遺傳變異的影響可能比培養(yǎng)時(shí)間還要大。這一點(diǎn)在通過

3、利用體細(xì)胞 無性系變異對桃進(jìn)行新品種培育中得到證實(shí)，得到的結(jié)果明顯依賴 于試驗(yàn)選擇的基因型。在對香蕉的研究中也發(fā)現(xiàn)離體培養(yǎng)導(dǎo)致的變異 范圍受品種的影響比受培養(yǎng)環(huán)境的影響大?；蚪M中存在不安定的部 分，這部分特別容易受影響而比其他部分表現(xiàn)出更高頻率的重排和 突變。因此，體細(xì)胞無性系變異并不是像通常認(rèn)為的隨機(jī)現(xiàn)象，在培 養(yǎng)過程中由于生調(diào)節(jié)劑的存在，這些特殊位點(diǎn)比其他位點(diǎn)的變異頻 率更高。多倍體細(xì)胞可能早就存在于親本組織中，在90 %種類的植 物的已分化組織中發(fā)現(xiàn)核內(nèi)多倍體，只有枝的分生組織區(qū)由二倍體 細(xì)胞組成；較少情況下，根的分生組廣西師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版） 第10卷織區(qū)也由二倍體細(xì)胞組成。一

4、段成熟的莖或根，通常既含有 二倍體細(xì)胞又含有多倍體細(xì)胞，而且兩者均可被刺激而分裂，形成 愈傷組織；有些培養(yǎng)基可能優(yōu)先促進(jìn)較高倍性細(xì)胞的分裂。因此，快 速繁殖取材時(shí)，有必要對外植體的遺傳穩(wěn)定性進(jìn)行研究。多年生木本 植物在其發(fā)育過程中都要經(jīng)過幼年期和成年期兩個(gè)階段。相關(guān)學(xué)者認(rèn) 為:幼年階段是種子萌發(fā)后的一段時(shí)間，在這段時(shí)間內(nèi)實(shí)生苗不能 被任何方法誘導(dǎo)開花此期包括胚長成幼齡植物的過程。實(shí)生苗通過莖 與根的延長和增粗而增大體積時(shí)，營養(yǎng)生長占優(yōu)勢，到了具有開花 能力的時(shí)候，便表明幼年階段的結(jié)束，成年階段的開始。這兩個(gè)階段 在樹型、解剖結(jié)構(gòu)細(xì)胞生物學(xué)等方面都有很大的差異。幼年型和成年 型差異的產(chǎn)生，主要在

5、莖尖生長錐中進(jìn)行。幼年型和成年型的變化屬 于體發(fā)育的變化。由于多年生木本植物個(gè)體發(fā)育的特點(diǎn)，即順序性、 不可逆性和局限性。因此，同一株植株不同部位個(gè)體發(fā)育年齡可能很 不相同。一種植物它的下部分處于幼年型而上部分處于成年型。也就 是說，多年生木本植物莖的下部分在形態(tài)上最早形成，從生長年齡來 說它們是最大或較大，但從階段發(fā)育來說，它們質(zhì)變的程度是淺的或 較淺，所以就發(fā)育年齡來說是年幼的；莖的上部則相反，形態(tài)上形成 最遲或較遲，生長年齡是幼或較幼，而階段發(fā)育是年老的，質(zhì)變程度 是深或較深。所以，從發(fā)育方面看幼年型和成年型在形態(tài)、生理、遺 傳等方面都有質(zhì)的差異性。解決外植體對組織培養(yǎng)物遺傳穩(wěn)定性的影響

6、的措施，首先是選取 正常枝進(jìn)行無性繁殖，芽變是可以減少到最低限度的，即使有芽變， 只要是次要的，局部的，也不會(huì)影響優(yōu)良性狀的保持。生產(chǎn)上就是利 用成年枝條的無性繁殖來保持母株的優(yōu)良性狀。很多多年生木本植物 雖然樹體上部已達(dá)到成年期，而基部卻仍在幼年期。同樣，由根上發(fā) 生的不定芽，或重短截后由莖基部發(fā)生的不定芽，或球芽（具有分生組 織和輸導(dǎo)組織的瘤狀生長體）都趨于產(chǎn)生表現(xiàn)幼齡期的植株。因此， 用組培方法進(jìn)行快速無性繁殖，如為了得到生長快、分枝少，樹木粗 壯、高大的林木，則宜用幼年型的外植體；如為了得到人們選定培養(yǎng) 的優(yōu)良品種（例：果樹等經(jīng)濟(jì)植物）以及珍稀植物基因庫的保存， 則最好不要從樹木階段發(fā)

7、育比較幼齡的下部枝條上采取外植體，尤 其不應(yīng)該從根頸長出來的根莫上采取，也不應(yīng)該從種子萌發(fā)長成的實(shí) 生苗上采取。另外，即使是用成年型的枝作外植體，其成苗方式也不 應(yīng)采用愈傷組織或不定胚的方式再生植株。因愈傷組織或不定胚細(xì)胞 已重返幼態(tài)，由之再生的植株是幼態(tài)的，這不僅表現(xiàn)幼齡期特性， 而且童期長，甚至產(chǎn)生變異株?？傊?，要取得成年型的外植體及保持 母株成年型的優(yōu)良栽培性狀，最好從植株的上部獲得個(gè)體發(fā)育較老 的外植體，并用早熟腋生枝及直接從器官外植體再生植株的方式進(jìn) 行組培快速繁殖。第二，繼代培養(yǎng)是對植物離體快速繁殖遺傳穩(wěn)定性的影響。離體 培養(yǎng)植株在長期的繼代培養(yǎng)過程中往往會(huì)發(fā)生生理和遺傳的變化，這

8、 些變化及其內(nèi)在聯(lián)系在很早的研究中就被人們所關(guān)注。一些學(xué)者認(rèn)為 植株“衰老”是由變異引起，而有的學(xué)者認(rèn)為是營養(yǎng)（培養(yǎng)基）和培養(yǎng) 時(shí)間對離體培養(yǎng)材料器官發(fā)生能力有更重要的影響。于是，有學(xué)者提 出，棉花胚性愈傷組織的繼代時(shí)間不宜超過1. 5年，有關(guān)認(rèn)為刺梨愈 傷組織的繼代數(shù)應(yīng)控制在10代以內(nèi)。綜合大量參考文獻(xiàn)，發(fā)現(xiàn)多數(shù)材 料在繼代1年以上（以4周繼代1次計(jì)算，繼代13次），培養(yǎng)物的形態(tài)發(fā) 生能力和遺傳穩(wěn)定性等都將會(huì)有較大程度的變化。因此，可將繼代時(shí) 間超過1年，或繼代次數(shù)超過13次的繼代培養(yǎng)稱為長期繼代培養(yǎng)。當(dāng) 材料的繼代年限大于這一臨界值時(shí)，可將其作為長期繼代培養(yǎng)物來研 究。長期繼代與形態(tài)發(fā)生能

9、力。在植物組織培養(yǎng)的早期研究中。許 多學(xué)者就發(fā)現(xiàn)長期繼代培養(yǎng)會(huì)導(dǎo)致“馴化”現(xiàn)象。除了馴化以外，往 往還會(huì)逐漸衰退，具體表現(xiàn)在生長不良。再生能力和增殖率下降，甚 全喪失形態(tài)發(fā)生能力。有關(guān)學(xué)者研究指出，繼代次數(shù)多少影響著試管 苗的增殖系數(shù)。多種植物組培苗起始培養(yǎng)初期，繼代增殖和生根能力 較低，隨繼代次數(shù)的增加，繁殖能力顯著增加。長期繼代與遺傳穩(wěn)定 性在繼代培養(yǎng)過程中，植株的體細(xì)胞無性系變異廣泛存在。這些變異 有的是不能遺傳的變異即表觀遺傳變異。但大多數(shù)是可遺傳變異。變 異既可表現(xiàn)在染色體水平上，又可表現(xiàn)在分子水平上。許多研究也 證實(shí)，愈傷組織長期培養(yǎng)會(huì)產(chǎn)生多倍體、非整倍體或染色體斷裂和重 組或基因

10、突變等情況，有報(bào)道指出，隨著繼代次數(shù)的增加，植株變 異率明顯提高，有研究者發(fā)現(xiàn)，長期培養(yǎng)（10年）的桃愈傷組織變異率 由0. 7 %提高到了 10 %。其中的原因可能是隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，變 異逐漸表現(xiàn)出來，還有可能是早期存在的變異隨著繼代不斷累積，而 有些變異穩(wěn)定且無法逆轉(zhuǎn)（如矮化現(xiàn)象），或者是這兩種情況同時(shí)存 在，這些都是導(dǎo)致在培養(yǎng)后期發(fā)現(xiàn)較高變異率的原因。但是，并不是 隨著時(shí)問的增長，染色體變異有無限增加的趨勢。些外植體在培養(yǎng)初 期具有的胚胎和器官發(fā)生的潛力.經(jīng)過長期繼代培養(yǎng)后，其形態(tài)發(fā)生 的能力多會(huì)有所下降，甚至完全喪失，這種情況與體細(xì)胞無性系變異 有著很大關(guān)系。第三，植物生長物質(zhì)和器

11、官發(fā)生方式是誘導(dǎo)變異的重要原因之 一。再生植株遺傳物質(zhì)發(fā)生變異是植物組織培養(yǎng)過程中經(jīng)常發(fā)生的現(xiàn) 象，而且也是植物育種者所關(guān)注的，重要方面。外源激素和離體培養(yǎng) 等因素可以引起體細(xì)胞變異。這種變異反映在再生植株的基因組DNA 上，如 DNA堿基缺失或堿基改變。在染色體倍性沒有改變的條件下， 在DNA水平上發(fā)生了 一定程度的變異，這種分子水平上的差異可以通 過基因組DNA標(biāo)記手段檢測出來。器官發(fā)生途徑則不受取材時(shí)間的限 制，并且它是一種簡單快速的再生不定芽的方法。器官發(fā)生途徑有兩 種方式，外植體經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)形成不定芽或直接誘導(dǎo)產(chǎn)生不定 芽。外植體經(jīng)過愈傷組織誘導(dǎo)和直接誘導(dǎo)產(chǎn)生再生植株是否會(huì)發(fā)生變

12、 異，而基因工程要求再生材料的遺傳穩(wěn)定性越高越好。針對這些，提高遺傳穩(wěn)定性的措施：在進(jìn)行植物快繁時(shí)，應(yīng)盡 量采用不容易發(fā)生變異的體細(xì)胞增殖途徑，以減少或避免植物個(gè)體或 細(xì)胞發(fā)生變異。采用莖尖培養(yǎng)啟動(dòng)腋芽生枝、不定芽生枝、體細(xì)胞分 化胚狀體的繁殖方式，都可有效地減少變異。繼代培養(yǎng)時(shí)，不要繼代 次數(shù)過多。注意材料的更新，每隔一段時(shí)期需重新接種外植體后，再 進(jìn)行繼代培養(yǎng)。使用激素濃度不要過高，不要加入容易引起植物變異 的化學(xué)物質(zhì)。定期對試管苗和移栽苗進(jìn)行觀察，及時(shí)剔除生理、形態(tài) 異常苗，并進(jìn)行多年跟蹤檢測，調(diào)查再生植株開花結(jié)實(shí)特性，以確定 其生物學(xué)性狀和經(jīng)濟(jì)性狀是否穩(wěn)定。綜上所述，降低遺傳變異的方法

13、選用不易發(fā)生遺傳變異的基因型 材料；縮短繼代時(shí)間，限制繼代次數(shù)；選用不易發(fā)生遺傳變異的增殖 途徑和器官發(fā)生方式；采用適當(dāng)?shù)纳L調(diào)節(jié)物質(zhì)和激素濃度，減少或 不使用易引起誘變的物質(zhì)，及時(shí)剔除生理和形態(tài)異常苗。主要參考文獻(xiàn):劉玲梅，湯浩茹，劉娟.試管苗長期繼代培養(yǎng)中的形態(tài)發(fā)生能力與 遺傳穩(wěn)定性N.生物技術(shù)通報(bào),2008，(5):22-27.劉石泉，李小軍，周根余.鐵皮石斛不同繁殖代數(shù)遺傳穩(wěn)定性 RAPD的研究N.大學(xué)學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版),2005，4(5):518-521.何斌，侯恩太，王英娟，等.小蔓長春花南組織培養(yǎng)快速繁殖中的 遺傳穩(wěn)定性N.植物生理學(xué)報(bào)，2012,48(2) : 197-201.

14、張魯，張春艷，李天祥.藥用植物快速繁殖的研究進(jìn)展J.中國現(xiàn) 代中藥,2011,13(10):43-51.5陳發(fā)菊，趙志剛，梁宏偉，等.銀鵲樹胚性愈傷組織繼代培養(yǎng)過程 中的細(xì)胞染色體數(shù)目變異N.西北植物學(xué)報(bào)，2007，27(8) : 16O0 1604.姚慶榮，郭運(yùn)玲，孔華，等.影響木薯芽器官發(fā)生及植株再生的因素 J.農(nóng)業(yè)科學(xué),2010，38(30) : 16781 16783.郭艷茹，詹亞光.植物離體快繁中的常見問題及防止措施J.黑 龍江農(nóng)業(yè)科學(xué)2008(1) : 1921.8孫立平，章林，王曉娜.等.組培快繁應(yīng)重點(diǎn)解決的幾個(gè)問題J.吉 林林業(yè)科技,2009，38(4):46-53.金萬梅，董靜，王媛花，等.葡萄器官發(fā)生途徑再生不定芽的遺傳穩(wěn) 定性R.分子植物育種,2009，7(2):375 379.趙和祥，郭太君，宋潤剛，等.山葡萄新品種“左優(yōu)紅”莖尖組培苗 的遺傳穩(wěn)定性及生產(chǎn)性能的研究J.中外葡萄與葡萄酒實(shí)驗(yàn)研究， 2007，( 4)： 15-17.張恩讓，任媛媛，胡華群，等.大蒜分生組織培