甲醛與戊二醛固定劑對基于Ludox–QPS染色方法的研究結(jié)果對比

1、PAGE 8 -甲醛與戊二醛固定劑對基于LudoxQPS染色方法的研究結(jié)果對比王苗勛許媛關(guān)鍵詞：多樣性;群落結(jié)構(gòu);微型底棲動物;纖毛蟲;固定劑0引言微型底棲動物個體微小且為單細胞，在海洋微食物環(huán)中扮演著重要的角色.其蟲體脆弱，在離心分離過程中極易破碎.因此，如何有效地將其從沉積物中分離、固定并染色，成為微型底棲動物生態(tài)學(xué)研究的技術(shù)瓶頸1-3.徐奎棟等改進的密度梯度離心結(jié)合定量蛋白銀染色法（LudoxDensityGradientCentrifugationCombinedwithQuantitativeProtargolStaining，LudoxQPS）是研究微型底棲動物生態(tài)學(xué)的重要手段4-

2、5，并被納入了海洋微型底棲生物調(diào)查規(guī)范6中.樣品固定是影響LudoxQPS及后續(xù)統(tǒng)計分析的重要因素.理想的固定方法應(yīng)盡可能少地引起細胞損失以及形態(tài)變化，能夠真實地反映微型底棲動物的生活狀況7.固定方法不當，會導(dǎo)致部分物種丟失或形態(tài)破壞，不僅給鑒定造成困難，而且會導(dǎo)致對生物量的評估產(chǎn)生偏差，影響統(tǒng)計的準確性及對群落組成和多樣性的分析8-9.常見的固定劑類型有甲醛、戊二醛、魯哥氏液（Lugols）和波恩液（Bouins）等，種類繁多，性能也存在很大的差異10.類彥立等4和Xu等11比較了2%戊二醛、4%甲醛、10%Lugols液與5%Bouins液，認為酸性固定液（Lugols液與Bouins液）

3、會引起Ludox膠體的凝結(jié)，降低固定液的固定效能，不適合LudoxQPS研究4，11，pH值為中性的甲醛溶液與戊二醛溶液恰好滿足其條件.已有的海洋微型底棲生物調(diào)查規(guī)范建議使用終濃度為2%的戊二醛固定底棲纖毛蟲樣品6，但由于戊二醛固定的樣品存在長距離運輸受限的問題，使得在大地理尺度上進行微型底棲動物的研究受到限制.而經(jīng)甲醛固定的樣品在滿足一定條件下可以通過航空托運運輸，因此可滿足實驗樣品的遠距離運輸要求12.前人針對浮游類群的研究，發(fā)現(xiàn)固定劑類型及濃度會引起部分個體的損失及形態(tài)變化，進而影響對生物量的估計13.Turley等14在研究中發(fā)現(xiàn)戊二醛固定的浮游生物的數(shù)目會隨時間減少，并進一步證實了無

4、論甲醛固定還是戊二醛固定均會引起細胞數(shù)量的損失.Choi等15發(fā)現(xiàn)戊二醛固定引起鞭毛蟲蟲體的收縮小于甲醛固定，而對于寡毛類纖毛蟲而言，甲醛固定引起的收縮反而小于Lugols和戊二醛等固定劑.已有的文獻10，16-18也提到，甲醛是相對于其他固定劑（如戊二醛）對細胞體積影響最小的.曾鈺婷19對臺灣地區(qū)近海經(jīng)甲醛固定及室內(nèi)培養(yǎng)的浮游纖毛蟲結(jié)合定量蛋白銀染色研究發(fā)現(xiàn)，甲醛固定不影響“屬”級的鑒定，部分能夠鑒定到“種”級.上述研究均源自浮游樣品或室內(nèi)培養(yǎng)的有限種的分析結(jié)果，而對于底棲類群的報道甚少.迄今，國內(nèi)外針對固定劑類型對底棲類群影響的研究十分有限，僅有孟昭翠等20對采自黃海海域并經(jīng)甲醛固定的底棲

5、生物樣品的研究，發(fā)現(xiàn)底棲鞭毛蟲會隨固定時間延長而造成一定數(shù)量的低估.因此，為對比甲醛固定與戊二醛固定經(jīng)LudoxQPS染色后的微型底棲動物群落的研究結(jié)果是否具有可比性，本研究于2022年4月在上海南匯邊灘采集了3種生境的微型底棲動物樣品，并分別采用甲醛和戊二醛作為固定劑，后期進行LudoxQPS染色實驗并對比實驗結(jié)果.這為以后采用何種固定劑進行微型底棲動物生態(tài)學(xué)研究及采用不同固定劑的研究結(jié)果是否具有可比性提供相應(yīng)的研究依據(jù).1材料與方法1.1采樣區(qū)域、方法及固定方式本研究于2022年4月在上海市南匯邊灘（305139N，1215506E）選取光灘、海三棱藨草灘以及沙灘3種生境（圖1），每種生境

6、隨機選取兩個樣點作為平行樣.使用直徑約1.5cm的自制采樣器，在每個樣點隨機采集6個表層平行芯樣（02cm，約24mL），隨機分成2組（每組3個芯樣），一組使用終濃度1%的甲醛溶液固定，另一組使用終濃度2%的戊二醛溶液固定.1.2LudoxQPS及物種鑒定LudoxQPS實驗過程參照海洋微型底棲生物調(diào)查規(guī)范，依次對樣品進行稀釋降鹽、密度梯度離心、真空抽濾、瓊脂包埋、蛋白銀染色、脫水與封片等過程，獲得永久裝片6.使用光學(xué)顯微鏡（BX53，OLYMPUS，日本）在2001000倍下進行鏡檢，對目標生物測量長（L）和寬（D）6.參照宋微波等21、Carey1和Lynn22等分類文獻對纖毛蟲進行鑒定，

7、并根據(jù)各自特征進行類群劃分.1.3纖毛蟲生物量的計算通過鏡檢測量纖毛蟲個體的長（L）和寬（D），并根據(jù)蟲體最接近的幾何形狀計算體積（V），通過轉(zhuǎn)換系數(shù)對纖毛蟲的生物量進行估算.一般每種纖毛蟲隨機選取20只個體（如果個體不足20只則全部計數(shù)）進行測量，最后取平均值5，23.甲醛固定樣品的轉(zhuǎn)換系數(shù)為0.14pg/m3，戊二醛固定樣品的轉(zhuǎn)化系數(shù)為0.20pg/m35，24.1.4數(shù)據(jù)分析利用PrimerE7.0軟件對纖毛蟲豐度數(shù)據(jù)進行平方根轉(zhuǎn)換，并計算BrayCurtis相似性矩陣，在DIVERSE模塊中計算物種數(shù)（S）、個體數(shù)（N）、香農(nóng)維納多樣性指數(shù)（H）和均勻度指數(shù)（J）.公式如下：對底棲纖毛

8、蟲群落的物種組成、多樣性參數(shù)及生物量數(shù)據(jù)在0.05水平上進行ANOSIM（AnalysisofSimilarities）雙因素（生境類型和固定劑類型）交叉分析25.并根據(jù)BrayCurtis相似性矩陣進行NMDS（NonmetricMultidimensionalScaling）分析，以顯示不同固定劑、不同生境采集的底棲纖毛蟲群落物種組成的相似性.2結(jié)果2.1物種組成本研究中共檢獲底棲纖毛蟲26科33屬39種，分別屬于側(cè)口類、前口類、小胸類、盾纖類、核殘跡類、鉤刺類、腹毛類、寡毛類、膜口類及管口類10個類群.其中，甲醛固定的樣品中檢獲9類26種，戊二醛固定的檢獲10類26種（圖2），剛毛刺葉蟲

9、（Kentrophyllumsetigerum，屬于側(cè)口類）為優(yōu)勢種.2.2群落結(jié)構(gòu)2.2.1ANOSIM雙因子交叉分析ANOSIM雙因子（生境類型與固定劑類型）交叉分析結(jié)果表明：雖然不同生境（光灘、沙灘和海三棱藨草灘）中的底棲纖毛蟲群落之間存在顯著性差異（p0.05，表1），但兩種固定方式獲得的底棲纖毛蟲群落物種組成、多樣性參數(shù)（物種數(shù)、個體數(shù)、均勻度和香農(nóng)-維納多樣性指數(shù)）以及生物量均無顯著性差異（p0.05，表1）.2.2.2NMDS分析NMDS分析結(jié)果（stress=0.11）顯示，兩種固定方式固定的群落結(jié)構(gòu)之間區(qū)分不明顯，海三棱藨草灘與其他生境（光灘和沙灘）之間的群落結(jié)構(gòu)存在明顯區(qū)分

10、（圖3）.2.3底棲纖毛蟲生物量甲醛固定與戊二醛固定獲得的平均生物量分別為（0.320.11）gC/mL與（0.350.07）gC/mL.兩種固定方式獲得的底棲纖毛蟲生物量在不同生境（海三棱藨草灘、光灘和沙灘）中的分布狀況趨同（圖4），通過ANOSIM雙因子交叉分析結(jié)果（表1）可知，底棲纖毛蟲群落的生物量在不同生境間存在顯著性差異（p0.01），但在兩種固定方式之間不存在顯著性差異（p0.05）.2.4兩種固定方式的LudoxQPS染色效果甲醛固定與戊二醛固定的樣品經(jīng)過LudoxQPS染色后獲得的纖毛蟲染色圖式如圖5所示.兩種方法獲得的蟲體形態(tài)均基本完整，無明顯收縮;纖毛圖式染色尚可;細胞內(nèi)質(zhì)

11、著色均勻，且多數(shù)個體細胞核清晰可見.可根據(jù)其纖毛排列、口區(qū)位置及細胞核形狀與數(shù)目等結(jié)構(gòu)，將其鑒定到“屬”級甚至“種”級的水平（圖5）.3討論3.1固定劑的性質(zhì)甲醛溶液與戊二醛溶液都是微型底棲生態(tài)學(xué)中常見的固定劑，兩者在性能上存在較大差異26-30.甲醛穿透能力較弱，對細胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)保存效果不佳，僅能夠滿足普通光學(xué)顯微鏡觀察的需求;而戊二醛對細胞核以及膜系統(tǒng)的保存能力優(yōu)于甲醛，對細胞內(nèi)的超微結(jié)構(gòu)能夠很好地保存，可滿足分辨率更高的電鏡觀察31.甲醛與戊二醛作為固定劑均會在一定程度上引起目標生物的形態(tài)發(fā)生變化13，15，但也有學(xué)者認為，甲醛固定能夠減少蟲體的收縮程度，更能夠客觀地反映實際生物量狀況

12、15.甲醛溶液與戊二醛溶液不會造成Ludox硅膠液凝結(jié)，均適合LudoxHS40硅膠液對微型底棲動物進行提取2，但采用戊二醛固定的樣品還需在冷凍條件下保存.3.2兩種固定方式對物種鑒定的影響本研究采用甲醛固定與戊二醛固定兩種方式結(jié)合LudoxQPS染色獲得的纖毛蟲圖式（圖5），與前人研究中（均由戊二醛固定）采用LudoxQPS染色獲得的底棲纖毛蟲圖式效果一致2，5，32，均可根據(jù)體表纖毛結(jié)構(gòu)、口區(qū)結(jié)構(gòu)等特征鑒定到“屬”級或“種”級.前人對浮游類群纖毛蟲利用甲醛或戊二醛固定，同樣可以通過形態(tài)特征辨別至“屬”和“種”級水平33-34，可見兩種固定方式對纖毛蟲種類的辨別無明顯影響.相關(guān)研究結(jié)果不僅能

13、提供底棲纖毛蟲形態(tài)方面的信息，還能計算生態(tài)學(xué)分析所需的豐度、豐富度、物種數(shù)等生物群落數(shù)據(jù)，數(shù)據(jù)可用于后續(xù)的ANOSIM分析和NMDS分析等過程，為開展微型底棲動物生態(tài)學(xué)研究提供便利.3.3不同固定方式獲得的底棲纖毛蟲群落結(jié)構(gòu)對比針對甲醛固定與戊二醛固定的采自3種生境的底棲纖毛蟲群落，經(jīng)過ANOSIM分析（表1），結(jié)果表明，其群落的物種組成、4種群落多樣性參數(shù)（物種數(shù)、個體數(shù)、均勻度，香農(nóng)維納多樣性指數(shù)）以及生物量方面均差異不顯著（p0.05）.NMDS分析（stress=0.11，介于0.1到0.2之間）同樣表明，同一生境的兩種固定劑固定的底棲纖毛蟲群落的物種組成相似.與Xu等35在相同區(qū)域的

14、研究比較，優(yōu)勢種（Kentrophyllumsetigerum）未發(fā)生改變，但豐度和多樣性較低，其原因可能與樣品的采集時間或采集強度有關(guān).海三棱藨草灘、光灘和沙灘的多種環(huán)境因子存在明顯的差異35，是造成物種組成、均勻度、個體數(shù)和生物量間顯著性差異（表1，p0.05）的主要原因.前人在浮游樣品的研究中認為，無論何種固定劑（甲醛或戊二醛）細胞數(shù)目隨時間均會在一定程度上影響數(shù)據(jù)的呈現(xiàn)36，在底棲樣品中，孟昭翠等20研究發(fā)現(xiàn)，甲醛固定的微型底棲動物（鞭毛蟲）樣品保存4個月比保存1個月豐度降低47.4%，但短時間內(nèi)影響有限.本研究在樣品采集后4d內(nèi)即完成LudoxQPS染色，在一定程度上減少了保存時間對

15、定量研究的影響.目前，尚無直接證據(jù)表明甲醛與戊二醛兩種固定方式對研究結(jié)果產(chǎn)生差異，說明甲醛可作為微型底棲動物的固定劑用于固定LudoxQPS實驗所需的材料，并且可將其研究結(jié)果與戊二醛固定后的研究結(jié)果進行比較.3.4特殊類群的比較本研究中膜口類（Maritujapelagica，1種，占1.32%，圖2）僅出現(xiàn)在戊二醛固定的樣品中，未出現(xiàn)在甲醛固定的樣品中，該現(xiàn)象或許與固定劑的固定能力有關(guān).然而，與馬族航32對崇明東灘濕地的底棲纖毛蟲群落和劉華雪等37對南海區(qū)域的微型動物群落的研究對比，前者以戊二醛（終濃度2%）為固定劑，后者以甲醛（終濃度2%）為固定劑，均能固定到大量的膜口類纖毛蟲.本研究中前口類（占32.92%）、側(cè)口類（占19.88%）和腹毛類（占13.35%）等類群占極大優(yōu)勢，與已有的研究結(jié)果基本吻合26，