基于磁珠微陣列的多重血型檢測(cè)技術(shù)

1、基于磁珠微陣列的多重血型檢測(cè)技術(shù)來(lái)源： ： 時(shí)間：2022-10-27 【】 張強(qiáng)； 陳藝心； 趙樹(shù)銘； 【機(jī)構(gòu)】 第三軍醫(yī)大學(xué)第一附屬醫(yī)院輸血科； 第三軍醫(yī)大學(xué)大坪醫(yī)院檢驗(yàn)科；【摘要】 目的 建立并評(píng)價(jià)基于磁珠微陣列技術(shù)的血型表型的鑒定方法。方法 用Tris-HCl(0.01 mol/L,p H 7.4)裂解濃縮紅細(xì)胞作為待檢樣本,將探針抗體包被于經(jīng)醛基修飾的三維基片上,將待測(cè)樣本與抗體進(jìn)行反應(yīng),最后用C1q包被的磁珠識(shí)別抗原抗體復(fù)合物,在磁針的磁力吸附下將未結(jié)合的磁珠清除。顯微攝影每個(gè)微陣列檢測(cè)點(diǎn),通過(guò)Photoshop圖像分析判斷信號(hào)強(qiáng)度。結(jié)果 針對(duì)108個(gè)檢測(cè)樣本的5種抗原(A、B、D

2、、M、N)進(jìn)行分析,以含有40%甘油的PBS做為反應(yīng)介質(zhì)能有效避免咖啡環(huán)的形成,方法敏感性為86%93%,特異性為98%100%。通過(guò)C1q包被的磁珠識(shí)別抗原抗體復(fù)合物能在1020 min完成檢測(cè),所需樣本10L。結(jié)論 本方法有較高的敏感性與特異性,同一個(gè)芯片上可同時(shí)檢測(cè)5種血型抗原,節(jié)約樣本,且不受樣本損傷的影響,為血型鑒定提供了一種新的手段。【關(guān)鍵詞】 輸血； 血型鑒定； 蛋白質(zhì)芯片； 磁珠芯片； 目前人類(lèi)已發(fā)現(xiàn)35個(gè)血型系統(tǒng)、包含1500多個(gè)等位基因1，其中很多編碼的血型抗原具有重要的臨床意義。自ABO血型系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)以來(lái)，輸血安全性得到極大的提高。然而，隨著更多的血型抗原的發(fā)現(xiàn)，為了更大程

3、度上保證輸血的安全性，血型鑒定靶標(biāo)將不僅限于A、B及hD抗原。現(xiàn)有血型鑒定技術(shù)包含基因分型與表型分型兩大類(lèi)。基因分型如PC、測(cè)序以及基因芯片等2，這些技術(shù)雖然靈敏度高，但設(shè)備及人員技能要求高，且耗時(shí)較長(zhǎng)，不適合于急救或戶外應(yīng)用。 現(xiàn)有的表型分型技術(shù)雖然能有效降低設(shè)備、人員、時(shí)間成本，但靈敏度受到一定限制，且均只能針對(duì)單個(gè)抗原進(jìn)行檢測(cè)，不能滿足未來(lái)多重血型檢測(cè)的臨床要求3。為此，本研究將微陣列技術(shù)與磁珠分離技術(shù)相接合，建立一種快速多重的血型鑒定技術(shù)。1材料與方法11樣本收集與處理經(jīng)獻(xiàn)血員同意后留取血液樣本，EDTA-K2抗凝后離心取100L濃縮紅細(xì)胞，用PBS(001mol/L，pH74)洗滌3

4、次后用1mLTris-HCl(001mol/L，pH74)存放4裂解，最后以10LPBS重懸待用12微陣列芯片的制備選用醛基修飾的三維基片(CapitalBio，755mm252mm10mm)作為反應(yīng)基片。每張基片分為6個(gè)反應(yīng)區(qū)，每個(gè)反應(yīng)區(qū)包含8個(gè)檢測(cè)點(diǎn)(42陣列)，用于一種抗原的檢測(cè)。人IgG及血型抗體探針(單克隆抗體A、B、D、M、N，Abacam公司)包被于各個(gè)檢測(cè)區(qū)，每個(gè)點(diǎn)點(diǎn)樣02L(100g/mL，Abcam公司)。37溫育30min后用10g/L牛血清清蛋白(BSA)封閉(加拿大BBI公司)，隨后置于4保存?zhèn)溆谩?3C1q包被磁珠取100L超順磁珠(SM3-P100磁珠，上海奧潤(rùn)公

5、司)用001mol/L嗎啉乙烷磺酸吐溫(MES，上海生工公司，005%吐溫-20)清洗3次，加100L5mg/mL偶聯(lián)劑3-(二甲基氨基)丙基乙酯碳亞胺鹽酸鹽(EDC，加拿大BBI公司)與100L5mg/mLN-羥基丁二酰亞胺(NHS，上海生工公司)混勻，37振蕩偶聯(lián)30min。磁分離去上清后加100LC1q(100g/mL，Abacam公司)，37振蕩偶聯(lián)30min。最后以10g/LBSA封閉，置于4保存?zhèn)溆谩?4血型微陣列檢測(cè)在包被有抗體探針的反應(yīng)點(diǎn)上加待測(cè)樣品02L，隨后加02LC1q偶聯(lián)的磁珠，室溫反應(yīng)1020min后用磁針吸去未接合磁珠。15傳統(tǒng)血清學(xué)鑒定所有樣本的A，B，D，M，N采用微柱凝膠法進(jìn)行鑒定(抗A，B，上海血液公司，抗D，M