生物制藥工藝學(xué)基因工程制藥課件

1、基因工程制藥1醫(yī)學(xué)ppt基因工程制藥1醫(yī)學(xué)ppt第一節(jié) 概述 第二節(jié) 基因工程藥物的生產(chǎn)的過程第三節(jié) 目的基因的獲得第四節(jié) 基因表達(dá)第五節(jié) 基因工程菌生物代謝的特點(diǎn)第六節(jié) 基因工程菌的不穩(wěn)定性第七節(jié) 基因工程菌中試第八節(jié) 重組工程菌的培養(yǎng)第九節(jié) 高密度發(fā)酵第十節(jié) 基因工程藥物的分離純化第十一節(jié) 變性蛋白的復(fù)性第十二節(jié) 基因工程藥物的質(zhì)量控制第十三節(jié) 基因工程藥物的制造實(shí)例2醫(yī)學(xué)ppt第一節(jié) 概述 2醫(yī)學(xué)ppt第一節(jié) 概述基因工程的概念 基因工程又稱為重組DNA技術(shù)或基因克隆技術(shù),在分子水平上進(jìn)行遺傳操作，按設(shè)計(jì)的藍(lán)圖，從供體中提取或人工合成目的基因，令其與載體構(gòu)建成重組DNA，再轉(zhuǎn)移到受體細(xì)胞

2、，目的基因在細(xì)胞中表達(dá)得到期望的由這個(gè)外源基因所編碼的蛋白質(zhì),獲得新的遺傳性狀 。3醫(yī)學(xué)ppt第一節(jié) 概述基因工程的概念 基因工程又稱為重組DNA技 基因工程的誕生打破了物種的界限，實(shí)現(xiàn)了物種間的基因交流，在實(shí)驗(yàn)室里對(duì)生物直接進(jìn)行改造，為生命科學(xué)的研究開辟了新的領(lǐng)域、注入了新的方法，為提高人類的生活質(zhì)量和健康水平開辟了新的途徑，在農(nóng)業(yè)、工業(yè)、醫(yī)藥等領(lǐng)域有巨大的應(yīng)用前景。4醫(yī)學(xué)ppt 基因工程的誕生打破了物種的界限，實(shí)現(xiàn)了物種間的基因基因工程是生物技術(shù)的核心，基因工程技術(shù)的成就之一是用于生物治療的新型藥物的研制。世界上第一個(gè)基因工程產(chǎn)品人胰島素（美國(guó)，1982年）中國(guó)第一個(gè)基因工程藥物1b干擾素

3、（1997年）美國(guó)是現(xiàn)代生物技術(shù)的發(fā)源地，一直穩(wěn)居生物藥物研發(fā)榜首。5醫(yī)學(xué)ppt基因工程是生物技術(shù)的核心，基因工程技術(shù)的成就之一是用于生物治為什么選擇基因工程傳統(tǒng)制藥存在的問題： A.材料來源困難或制造技術(shù)問題而無法付諸應(yīng)用； B.內(nèi)源生理活性物質(zhì)，或造價(jià)太高，令人望而卻步，或來源困難而供不應(yīng)求； C.由于免疫抗原等緣故，使它們?cè)谑褂蒙鲜艿较拗疲?D.提取中難免感染，后果嚴(yán)重。 基因工程技術(shù)的特點(diǎn)：就是能夠十分方便有效地生產(chǎn)許多以往難以大量獲取的生物活性物質(zhì)，甚至可以創(chuàng)造出自然界中不存在的全新物質(zhì)。6醫(yī)學(xué)ppt為什么選擇基因工程傳統(tǒng)制藥存在的問題：6醫(yī)學(xué)ppt生化提取 基因工程表達(dá)人生長(zhǎng)激素（

4、侏儒癥）成本高產(chǎn)量低質(zhì)量難以保證成本低產(chǎn)量高活性強(qiáng)性質(zhì)優(yōu) 50具新鮮尸體腦下垂體中提取 基因工程1-2升細(xì)菌培養(yǎng)液7醫(yī)學(xué)ppt生化提取 基因工程表達(dá)人生長(zhǎng)激素（基因工程藥物在解決癌癥、病毒性疾病、心血管疾病和內(nèi)分泌疾病等方面取得明顯的效果，為上述疾病的治療、預(yù)防和診斷提供了新型藥物、新型疫苗和新型診斷試劑。8醫(yī)學(xué)ppt基因工程藥物在解決癌癥、病毒性疾病、心血管疾病和內(nèi)分泌疾病等基因工程技術(shù)可生產(chǎn)的藥物和制劑包括：免疫性蛋白，如各種抗原和單克隆抗體；細(xì)胞因子，如各種干擾素、白細(xì)胞介素、集落刺激生長(zhǎng)因子、表皮生長(zhǎng)因子、凝血因子；激素，如胰島素、生長(zhǎng)激素、心素納；酶類，如尿激酶、鏈激酶、葡激酶、組織

5、型纖維蛋白溶酶原激活劑、超氧化物歧化酶。9醫(yī)學(xué)ppt基因工程技術(shù)可生產(chǎn)的藥物和制劑包括：免疫性蛋白，如各種抗原和基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)： a. 可大量生產(chǎn)過去難以獲得的生理活性多肽和蛋白質(zhì)； b. 可以提供足夠數(shù)量的生理活性物質(zhì)，以便對(duì)其生理生化和結(jié)構(gòu)進(jìn)行深入的研究，從而擴(kuò)大這些物質(zhì)的應(yīng)用范圍；c. 利用基因工程技術(shù)可以發(fā)現(xiàn)、挖掘更多的內(nèi)源性生理活性物質(zhì)；d. 內(nèi)源性生理活性物質(zhì)在作為藥物使用時(shí)存在的不足之處，可以通過基因工程和蛋白質(zhì)工程進(jìn)行改造；e. 利用基因工程技術(shù)可獲得新型化合物，擴(kuò)大藥物篩選 源。 10醫(yī)學(xué)ppt基因工程技術(shù)生產(chǎn)藥品的優(yōu)點(diǎn)：10醫(yī)學(xué)ppt關(guān)于中國(guó)20世紀(jì)70主末，開

6、始應(yīng)用DNA重組技術(shù)、淋巴細(xì)胞雜交瘤技術(shù)、細(xì)胞培養(yǎng)、克隆表達(dá)等技術(shù)開發(fā)新產(chǎn)品 改造傳統(tǒng)制藥工藝?！?63”高技術(shù)計(jì)劃在生物技術(shù)領(lǐng)域研究的三個(gè)主題之一是：新型藥物、疫苗和基因治療，重點(diǎn)是利用現(xiàn)代生物技術(shù)手段，開發(fā)化學(xué)合成法難以生產(chǎn)的藥品。我國(guó)基因工程藥物主要集中在仿制上。下游技術(shù)落后于上游技術(shù)11醫(yī)學(xué)ppt關(guān)于中國(guó)20世紀(jì)70主末，開始應(yīng)用DNA重組技術(shù)、淋巴細(xì)胞雜第二節(jié) 基因工程藥物生 產(chǎn)過程12醫(yī)學(xué)ppt第二節(jié) 基因工程藥物生 產(chǎn)過程12醫(yī)學(xué)ppt基因工程技術(shù)是將重組對(duì)象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿主細(xì)胞，構(gòu)建成工程菌(或細(xì)胞），實(shí)現(xiàn)遺傳物質(zhì)的重新組合，并使目的基因在工程菌內(nèi)進(jìn)行復(fù)制

7、和表達(dá)的技術(shù)13醫(yī)學(xué)ppt基因工程技術(shù)是將重組對(duì)象的目的基因插入載體，拼接后轉(zhuǎn)入新的宿基因工程藥物制造的主要步驟目的基因的克隆構(gòu)建DNA重組體構(gòu)建工程菌目的基因的表達(dá)外源基因表達(dá)產(chǎn)物的分離純化產(chǎn)品的檢驗(yàn)14醫(yī)學(xué)ppt基因工程藥物制造的主要步驟目的基因的克隆14醫(yī)學(xué)ppt制備基因工程藥物的基本過程獲得目的基因組建重建質(zhì)粒構(gòu)建基因工程菌培養(yǎng)工程菌產(chǎn)物分離純化除菌過濾半成品檢定成品檢定包裝15醫(yī)學(xué)ppt制備基因工程藥物的基本過程獲得目的基因組建重建質(zhì)粒構(gòu)建基因工基因工程的上游和下游目的基因載體重組DNA分子重組DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染工程菌大規(guī)模培養(yǎng)表達(dá)產(chǎn)物分離純化誘導(dǎo)上游下游實(shí)驗(yàn)室工廠化、產(chǎn)業(yè)

8、化、商口化16醫(yī)學(xué)ppt基因工程的上游和下游目的基因載體重組DNA分子重組DNA進(jìn)入基因工程重組菌構(gòu)建示意圖17醫(yī)學(xué)ppt基因工程重組菌構(gòu)建示意圖17醫(yī)學(xué)ppt上游階段： 主要是分離目的基因、構(gòu)建工程菌(細(xì)胞)。目的基因獲得后，最主要的就是目的基因的表達(dá)。選擇基因表達(dá)系統(tǒng)主要考慮的是保證表達(dá)的蛋白質(zhì)的功能，其次是表達(dá)的量和分離純化的難易。 此階段的工作主要在實(shí)驗(yàn)室內(nèi)完成。下游階段： 從工程菌的大量培養(yǎng)一直到產(chǎn)品的分離純化和質(zhì)量控制。此階段是將實(shí)驗(yàn)室的成果產(chǎn)業(yè)化、商品化，包括工程菌大規(guī)模發(fā)酵最佳參數(shù)的確立，新型生物反應(yīng)器的研制，高效分離介質(zhì)及裝置的開發(fā)，分離純化的優(yōu)化控制，高純度產(chǎn)品的制備技術(shù)，

9、生物傳感器等一系列儀器儀表的設(shè)計(jì)和制造，電子計(jì)算機(jī)的優(yōu)化控制等?；蚬こ趟幬锷a(chǎn)的上游和下游18醫(yī)學(xué)ppt上游階段：基因工程藥物生產(chǎn)的上游和下游18醫(yī)學(xué)ppt第三節(jié) 目的基因的獲得克隆基因的常用方法： 基因組文庫(kù)法（原核）反轉(zhuǎn)錄法（真核）PCR法（原核+真核）反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法（真核）化學(xué)合成法（原核+真核）舊基因改造法（原核+真核）19醫(yī)學(xué)ppt第三節(jié) 目的基因的獲得克隆基因的常用方法： 19醫(yī)學(xué)ppt一 構(gòu)建基因組文庫(kù)分離目的基因 基因組DNA（genomic DNA）：指代表一個(gè)細(xì)胞或生物體整套遺傳信息（染色體及線粒體）的所有DNA序列?；蚪M文庫(kù)：將某種細(xì)胞的基因組DNA切成一定大

10、小的片段，并與適當(dāng)?shù)妮d體重組后導(dǎo)入宿主細(xì)胞，這種含有整個(gè)基因組DNA信息的集合。20醫(yī)學(xué)ppt一 構(gòu)建基因組文庫(kù)分離目的基因 基因組DNA（genomic基因組文庫(kù)（DNA文庫(kù)）構(gòu)建流程 分離基因組DNA 限制酶 大小不同酶切片段 片段酶切、回收、純化 分別與適當(dāng)?shù)妮d體連接 載體 DNA連接酶 導(dǎo)入細(xì)胞 轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染 克隆 繁殖成菌落或嗜菌斑 鑒定 分子雜交、凝膠電泳等方法鑒定 篩選根據(jù)基因決定篩選策略21醫(yī)學(xué)ppt基因組文庫(kù)（DNA文庫(kù)）構(gòu)建流程 分離基因組DNA篩選根據(jù)基因組文庫(kù)法只適合原核基因的獲得，不適用于真核基因。Notice: Why ?22醫(yī)學(xué)ppt基因組文庫(kù)法只適合原核基因的獲得

11、，不適用于真核基因。Noti原核基因與真核基因的區(qū)別真核基因有內(nèi)含子真核細(xì)胞中單拷貝基因只是染色體DNA中很小一部分，為其10-5-10-7，即使多拷貝基因也只有10-5，因此從染色體中直接分離純化目的基因極其困難真核基因的反轉(zhuǎn)錄克隆法23醫(yī)學(xué)ppt原核基因與真核基因的區(qū)別真核基因有內(nèi)含子真核基因的反轉(zhuǎn)錄克隆二 反轉(zhuǎn)錄法從真核細(xì)胞中提取mRNA，以其為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，反轉(zhuǎn)錄合成與該mRNA互補(bǔ)的DNA（cDNA第一鏈），再以 cDNA第一鏈為模板，最終合成雙鏈DNA序列。cDNA不含內(nèi)含子。獲得cDNA文庫(kù)。24醫(yī)學(xué)ppt二 反轉(zhuǎn)錄法從真核細(xì)胞中提取mRNA，以其為模板，在反轉(zhuǎn)錄酶反

12、轉(zhuǎn)錄合成基因的步驟： mRNA的純化 cDNA第一鏈的合成 cDNA第二鏈的合成 cDNA的克隆 將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞 cDNA文庫(kù)的鑒定 目的cDNA克隆的分離和鑒定25醫(yī)學(xué)ppt反轉(zhuǎn)錄合成基因的步驟： mRNA的純化 cDNA克隆示意圖mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶ss-DNA逆轉(zhuǎn)錄酶ds-cDNAds-cDNARNaseH酶解除去mRNADNA聚合酶I核酸酶S126醫(yī)學(xué)pptcDNA克隆示意圖mRNA逆轉(zhuǎn)錄酶ss-DNA逆轉(zhuǎn)錄酶ds-1. mRNA的純化細(xì)胞內(nèi)含有3種以上的RNA，mRNA占細(xì)胞內(nèi)總RNA總量的2%5%，真核細(xì)胞中mRNA的3-末端含有一多聚腺苷酸polyA組成的末端，足以吸附于寡聚脫

13、氧胸苷酸Oligo(dt)-纖維柱上，可用親和層析法將mRNA從細(xì)胞總RNA中分離出來。27醫(yī)學(xué)ppt1. mRNA的純化細(xì)胞內(nèi)含有3種以上的RNA，mRNA占細(xì)2. cDNA第一鏈的合成可用寡聚脫氧胸苷酸（dt）作為引物，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下，開始cDNA鏈的合成。3. cDNA第二鏈的合成除去cDNA-mRNA雜合鏈中的mRNA鏈（堿解或RNaseH酶解）然后以cDNA第一鏈為模板開始合成cDNA第二鏈。由于第一鏈cDNA3-末端會(huì)形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)，所以可從這點(diǎn)開始合成第二鏈（Klenow酶或DNA聚合酶I）切除發(fā)夾結(jié)構(gòu)（核酸酶S1，專一性切除單鏈DNA）28醫(yī)學(xué)ppt2. cDNA第一鏈的合成可

14、用寡聚脫氧胸苷酸（dt）作為引物4. cDNA克隆用于cDNA克隆的載體有兩類： 質(zhì)粒DNA（如pUC、pBR322等） 10kb根據(jù)重組后插入的cDNA能否表達(dá)、轉(zhuǎn)錄和翻譯合成蛋白質(zhì)，又將載體分為： 表達(dá)型載體（pUC、gt11）有啟動(dòng)子 非表達(dá)型載體（pBR322、gt10 ）29醫(yī)學(xué)ppt4. cDNA克隆用于cDNA克隆的載體有兩類：29醫(yī)學(xué)pp5. 將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞以轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染的方向使重組DNA進(jìn)入宿主細(xì)胞。6. cDNA文庫(kù)的鑒定目的：評(píng)價(jià)庫(kù)的好壞表型改變 抗性基因失活和菌落或噬菌斑顏色改變結(jié)構(gòu)特征 凝膠電泳、分子雜交、DNA序列分析30醫(yī)學(xué)ppt5. 將重組體導(dǎo)入宿主細(xì)胞以轉(zhuǎn)

15、化或轉(zhuǎn)染的方向使重組DNA進(jìn)入7. 目的cDNA克隆的分離和鑒定核酸探針雜交法 根據(jù)目的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，人工合成相應(yīng)的單鏈寡核苷酸作為探針，眾cDNA文庫(kù)中分離特異的cDNA克隆。免疫反應(yīng)鑒定法 用表達(dá)型載體構(gòu)建的cDNA文庫(kù)，可用免疫學(xué)方法逐一鑒定各cDNA的表達(dá)產(chǎn)物，即以某種蛋白質(zhì)的抗體尋找相應(yīng)的cDNA克隆。31醫(yī)學(xué)ppt7. 目的cDNA克隆的分離和鑒定核酸探針雜交法31醫(yī)學(xué)pp三 PCR法直接克隆基因PCR-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (Polymerase chain reaction)PCR是一種模擬天然DNA復(fù)制過程，在有DNA模板、DNA聚合酶、引物和四種dNTP的情況下，通過高溫變

16、性（90-95)退火，延伸這樣反復(fù)循環(huán)的過程，在體外擴(kuò)增特異性DNA片段的分子生物學(xué)技術(shù)?？蓮幕蚪M中、載體上擴(kuò)增基因32醫(yī)學(xué)ppt三 PCR法直接克隆基因PCR-多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) (PolyPCR的條件模板 雙鏈DNA引物 dNTP 原材料：A、T、G、CDNA聚合酶 鏈的延伸33醫(yī)學(xué)pptPCR的條件模板 雙鏈DNAPCR三步曲PCR 反應(yīng)分三步完成：第一步 變性 -95高溫下，雙鏈DNA 變性成為單鏈。第二步 退火-適當(dāng)溫度下，引物 DNA結(jié)合在適于配對(duì)的DNA片斷上。第三步 延伸-72，由DNA 聚合酶催化，從引物開始利用四種脫氧核糖核苷酸合成目的基因DNA。34醫(yī)學(xué)pptPCR三步曲P

17、CR 反應(yīng)分三步完成：第一步 變性 -95PCR原理示意圖35醫(yī)學(xué)pptPCR原理示意圖35醫(yī)學(xué)ppt36醫(yī)學(xué)ppt36醫(yī)學(xué)ppt四 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法 反轉(zhuǎn)錄與聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）結(jié)合的方法：mRNA經(jīng)反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈后，不再合成cDNA第二鏈，而是在特異引物協(xié)助下，用PCR方法進(jìn)行擴(kuò)增，特異地合成目的cDNA鏈。37醫(yī)學(xué)ppt四 反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)法 反轉(zhuǎn)錄與聚合酶鏈反應(yīng)（P五 化學(xué)合成法較小的蛋白質(zhì)和多肽的編碼基因可以用人工化學(xué)合成法獲得?；瘜W(xué)合成法有個(gè)先決條件是：必須知道目的基因的核苷酸序列或目的蛋白質(zhì)的氨基酸序列，再按相應(yīng)的密碼子推導(dǎo)出DNA的堿基系列。方法：合成目的

18、基因DNA不同部位的兩條鏈的寡核苷酸短片段，再退火成為兩端形成粘性末端的DNA雙鏈片段，然后將這些雙鏈片段按正確的次序進(jìn)行退火連接成較長(zhǎng)的DNA片段，再用連接酶連接成完整的基因。設(shè)計(jì)合成純化組裝38醫(yī)學(xué)ppt五 化學(xué)合成法較小的蛋白質(zhì)和多肽的編碼基因可以用人工化學(xué)合成化學(xué)合成基因的限制：不能合成太長(zhǎng)的基因。最長(zhǎng)50-60 bp，只適用于克隆小分子肽的基因。人工合成基因時(shí)，遺傳密碼的簡(jiǎn)并會(huì)為選擇密碼子帶來很大困難，如用氨基酸順序推測(cè)核苷酸序列，得到的結(jié)果可能與天然基因不完 全一致，易造成中性突變。費(fèi)用太高。39醫(yī)學(xué)ppt化學(xué)合成基因的限制：不能合成太長(zhǎng)的基因。最長(zhǎng)50-60 bp六 對(duì)舊基因的改造 蛋白質(zhì)工程： 通過對(duì)基因功能相關(guān)區(qū)域的研究，采用基因修飾技術(shù)和點(diǎn)突變技術(shù)進(jìn)行基因新功能研究和再確認(rèn)，從而改變基因表達(dá)產(chǎn)物的生物學(xué)功能。4