阿霉素對(duì)人膽管癌細(xì)胞株FRH0201的生物學(xué)特性的影響

1、阿霉素對(duì)人膽管癌細(xì)胞株FRH0201的生物學(xué)特性的影響【關(guān)鍵詞】膽道腫瘤阿霉素腫瘤細(xì)胞,培養(yǎng)液細(xì)胞周期細(xì)胞大小A125A19【摘要】目的：觀(guān)察阿霉素長(zhǎng)時(shí)間作用對(duì)膽管癌細(xì)胞株FRH0201生物學(xué)活性的影響。方法：用2g/l的阿霉素同一濃度逐漸延長(zhǎng)時(shí)間作用于人膽管癌細(xì)胞株FRH0201細(xì)胞，經(jīng)反復(fù)作用挑選出能在含1g/l的阿霉素培養(yǎng)液中生存72h，去掉阿霉素后仍能繼續(xù)穩(wěn)定傳代生長(zhǎng)的細(xì)胞。無(wú)藥培養(yǎng)1月后進(jìn)展生物學(xué)行為的監(jiān)測(cè)。觀(guān)察細(xì)胞形態(tài)學(xué)，繪制生長(zhǎng)曲線(xiàn)和流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞周期，酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定細(xì)胞的腫瘤標(biāo)記物，激光共聚焦顯微鏡觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)的阿霉素的熒光強(qiáng)度。結(jié)果：阿霉素作用后FRH0201細(xì)胞形態(tài)學(xué)

2、有輕度改變，細(xì)胞倍增時(shí)間較親本細(xì)胞延長(zhǎng)3h，與親本細(xì)胞相比S期細(xì)胞增多16.89%，G1期細(xì)胞減少29.33%、G2期細(xì)胞增多12.46%。A125和A199試驗(yàn)組和親本組分別為9.14和8.60U/l，1.59和2.96U/l，細(xì)胞內(nèi)阿霉素濃度熒光強(qiáng)度平均值，親本細(xì)胞為1764.8，試驗(yàn)組細(xì)胞為305.4。結(jié)論：阿霉素對(duì)膽管癌細(xì)胞株FRH0201的形態(tài)學(xué)及倍增時(shí)間無(wú)明顯影響，但使細(xì)胞進(jìn)入S期、G2期的增多，細(xì)胞內(nèi)藥物濃度明顯降低，生長(zhǎng)時(shí)間無(wú)明顯變化。【關(guān)鍵詞】膽道腫瘤阿霉素腫瘤細(xì)胞，培養(yǎng)液細(xì)胞周期細(xì)胞大小A125A199Theeffetsfadrayinnthehuanliverhilarh

3、langiarinnaelllineFRH0201【ABSTRAT】bjetive:TinvestigatetheeffetsfadrayinnelllinefFRH0201.ethds:Huanhilarhlangiarinnaelllineereulturedithadrayin(2g/l)thrughlastingdifferentties,finallythiselllineansurviveafter72hulturedintheultureliquidiththeadrayin(1g/l).Thentheediuasreplaedithafreshneithutadrayin,an

4、dtheellserentinuuslyulturedfr1nth.Theinvitrstudiesinludedthebservatinftheappearaneithptialirspe,TTellprliferatinassay,analysisftheellylebyFlytetry(FAS),assaysfturarkerusingenzyelinkediunsrbentassay(ELISA),thefluresenedensityfadrayin.Results:paredttheparentFRH0201ellline:Therphlgyshedtypialrphlgialha

5、rateristis,thedublingtieprlngedabut3h,theellylebyflytetryidentifiedinG1,G2andSphasefellyleere40.50%,19.74%and39.77%intrialgrup,and69.83%,7.29%and22.88%inparentgrup,respetively.Turarkerhasndifferenebeteenthe,thefluresenedensityfepirubiindesending5.2ties.nlusin:Theadrayinanaffettheellyleandausethehang

6、efetablis.【KEYRDS】BiliarytratneplassAdrayinTurells,ulturedellyleellsizeA125A199目前，肝門(mén)部膽管癌手術(shù)切除率已明顯進(jìn)步，手術(shù)病死率明顯下降，但真正到達(dá)根治性切除的病例很少，部分復(fù)發(fā)率很高，現(xiàn)有的化療及放療未見(jiàn)明顯的效果。其原因可能與肝門(mén)部膽管癌的生物學(xué)特性有關(guān)1。為此，我們觀(guān)察阿霉素長(zhǎng)時(shí)間作用對(duì)膽管癌細(xì)胞株FRH0201生物學(xué)活性的影響。1材料和方法1.1材料阿霉素購(gòu)于深圳萬(wàn)樂(lè)公司，TT購(gòu)自愛(ài)博生物工程，胎牛血清購(gòu)自杭州四季青公司。膽管癌細(xì)胞株FRH0201由本課題組吳小鵬教授構(gòu)建2。1.2方法采用濃度一樣不斷增加作

7、用時(shí)間的方法確定阿霉素培養(yǎng)液終濃度為1g/l。首先分別向FRH0201細(xì)胞株的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)參加不同濃度的阿霉素Adrayin,ADR，培養(yǎng)3d后觀(guān)察細(xì)胞死亡情況。結(jié)合阿霉素的血漿濃度，選擇可將50%的細(xì)胞抑制的藥物濃度I50作為耐藥細(xì)胞培養(yǎng)的起始濃度2g/l，將腫瘤細(xì)胞置于該培養(yǎng)液中和不含藥物的10%小牛血清RPI1640培養(yǎng)液培養(yǎng)，待細(xì)胞穩(wěn)定生長(zhǎng)、進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，傳代兩次，再將挑選出的細(xì)胞在一樣藥物濃度培養(yǎng)液中繼續(xù)培養(yǎng)。經(jīng)過(guò)1，2，3，6，12，24，36，48，60，72h10個(gè)時(shí)間段約8個(gè)月的培養(yǎng)，最終使細(xì)胞可以在1g/l阿霉素培養(yǎng)液中持續(xù)穩(wěn)定生長(zhǎng)并傳代，然后脫藥培養(yǎng)1個(gè)月在檢測(cè)細(xì)胞的生物

8、特性。1.3觀(guān)察指標(biāo)1.3.1形態(tài)學(xué)觀(guān)察將兩株細(xì)胞分別爬片后經(jīng)HE染色，光鏡下進(jìn)展形態(tài)學(xué)觀(guān)察。1.3.2細(xì)胞倍增時(shí)間的測(cè)定取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本細(xì)胞即未用藥的細(xì)胞和阿霉素作用的細(xì)胞與試驗(yàn)組細(xì)胞各一瓶，0.25%胰蛋白酶消化，10%小牛血清1640培養(yǎng)液制成濃度為1104個(gè)/l的單細(xì)胞懸液，96孔板中每孔接種2001，37、5%2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。每天取3個(gè)復(fù)孔計(jì)數(shù)活細(xì)胞，計(jì)算平均值，連續(xù)觀(guān)察7d。以培養(yǎng)時(shí)間為橫軸，以細(xì)胞數(shù)的對(duì)數(shù)為縱軸，繪制半對(duì)數(shù)細(xì)胞生長(zhǎng)曲線(xiàn)，于生長(zhǎng)曲線(xiàn)上對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期內(nèi)取3組數(shù)據(jù)，根據(jù)最小二乘法進(jìn)展直線(xiàn)回歸，在直線(xiàn)上任取兩點(diǎn)Nt、N，根據(jù)以下公式計(jì)算細(xì)胞的倍增時(shí)間(Td3。T代表N

9、Nt的時(shí)間Td=TIg2/Ig(Nt/N1.3.3細(xì)胞周期分析取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的親本及實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞各1106個(gè)/l，制成單細(xì)胞懸液，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)展操作，于流式細(xì)胞儀F上行細(xì)胞周期分析。1.3.4腫瘤標(biāo)記物A125、A199分別將同等數(shù)量的親本及試驗(yàn)組細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，37、5%2飽和濕度孵箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期后，分別搜集培養(yǎng)液各10l，1000r/in離心5in后取上清，用酶聯(lián)免疫吸附法進(jìn)展A125及A199的檢測(cè)。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.1.3.5激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)將親本細(xì)胞與試驗(yàn)組細(xì)胞制備單層細(xì)胞爬片。將載玻片置于培養(yǎng)皿中10%小牛血清1640培養(yǎng)液制成濃度為1104個(gè)/l的單細(xì)胞

10、懸液，待細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)均勻布滿(mǎn)載玻片后參加2g/l阿霉素作用30in，PBS洗滌細(xì)胞2次，在磁共振共聚焦顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞內(nèi)的阿霉素濃度以熒光強(qiáng)度表示。然后計(jì)算平均值。2結(jié)果2.1形態(tài)學(xué)改變倒置顯微鏡下對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的FRH0201細(xì)胞呈鋪路石狀鑲嵌嚴(yán)密排列，細(xì)胞呈多邊形、梭形、圓形、不規(guī)那么形、三角形等各種形態(tài)，生長(zhǎng)活潑，細(xì)胞體積變大，折光性差，核漿比例變大，細(xì)胞核增大。有多核細(xì)胞，有異常核分裂相。2.2細(xì)胞倍增時(shí)間實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞倍增時(shí)間為23.6h，延長(zhǎng)了約3h。2.3細(xì)胞周期分析實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞與親本細(xì)胞相比：S期細(xì)胞增多16.89%，G1期細(xì)胞減少29.33%、G2期細(xì)胞增多12.46%。見(jiàn)圖1、2。2

11、.5激光共聚焦顯微鏡檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的阿霉素濃度以熒光強(qiáng)度表示，計(jì)算平均值。見(jiàn)圖3。3討論肝門(mén)膽管癌及膽囊癌術(shù)后化療是重要的輔助治療手段，但化療的敏感性不高。且可能存在個(gè)體性差異及可能誘發(fā)的腫瘤多藥耐藥性。為了臨床及根底方面對(duì)膽道惡性腫瘤綜合治療的研究，F(xiàn)RH0201細(xì)胞代表原發(fā)灶的所有細(xì)胞群體2，并已成功建立裸鼠動(dòng)物模型3、4，我們用阿霉素對(duì)該細(xì)胞株進(jìn)展干預(yù)，觀(guān)察對(duì)其生物學(xué)特性的影響。為了更接近臨床膽管癌化療反復(fù)間歇用藥的特點(diǎn)，對(duì)FRH0201細(xì)胞采用大劑量反復(fù)間歇同一濃度不同時(shí)間暴露，歷時(shí)8個(gè)月，獲得了穩(wěn)定生長(zhǎng)的細(xì)胞。本次試驗(yàn)不同于其它耐藥株固定藥物濃度，這更符合臨床用藥方式。在本實(shí)驗(yàn)中我們發(fā)如

12、今低氧時(shí)，腫瘤細(xì)胞在含有阿霉素的培養(yǎng)基中可以繼續(xù)生長(zhǎng)繁殖，一旦更換培養(yǎng)基后同樣劑量的藥物，細(xì)胞雖然可以繼續(xù)貼壁伸展。但藥物持續(xù)存在時(shí)卻出現(xiàn)凋亡細(xì)胞，隨著作用時(shí)間的延長(zhǎng)，凋亡細(xì)胞逐漸減少。該細(xì)胞生物學(xué)特性的研究將為下一步耐藥株的建立，討論膽管癌耐藥機(jī)理及逆轉(zhuǎn)耐藥奠定基矗以往研究發(fā)現(xiàn)，與親本細(xì)胞株比擬，耐藥細(xì)胞株在形態(tài)、構(gòu)造及代謝程度等方面均發(fā)生了顯著變化5。本實(shí)驗(yàn)細(xì)胞在無(wú)藥培養(yǎng)1個(gè)月后生長(zhǎng)穩(wěn)定，倍增時(shí)間稍有延長(zhǎng)，其分泌的腫瘤標(biāo)記物如A125、A199較親本細(xì)胞有所降低，這可能與藥物抑制細(xì)胞活性有關(guān)，也可能是藥物導(dǎo)致了細(xì)胞的分化有關(guān)，但是細(xì)胞排泄毒性藥物的作用得到了增強(qiáng)。我們推測(cè)這些生物學(xué)性狀的改

13、變與其耐藥表型親密相關(guān)，但其詳細(xì)機(jī)理尚有待進(jìn)一步研究。經(jīng)流式細(xì)胞儀分析發(fā)現(xiàn)，藥物處理前后試驗(yàn)組G1期細(xì)胞比親本組約減少29.33%，G2期細(xì)胞比親本組增加12.46%，S期細(xì)胞增多16.89%，說(shuō)明細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞周期限制從G1期進(jìn)入S期，然后阻滯于G2期，G2期的主要特征是RNA的合成和染色質(zhì)的螺旋化，此期對(duì)外界環(huán)境敏感，易受各種因素的影響6。提示根據(jù)藥物對(duì)膽管癌細(xì)胞周期各期的影響，在臨床上可以更好地選擇不同的化療藥物，結(jié)合用藥以增加療效，減少副作用。在經(jīng)藥物作用挑選后1月，細(xì)胞內(nèi)抗腫瘤藥物濃度仍明顯降低，證明了細(xì)胞穩(wěn)定表達(dá)了某種機(jī)制，該機(jī)制可以使腫瘤細(xì)胞耐受阿霉素的殺傷作用，但詳細(xì)的機(jī)制需要進(jìn)

14、一步證實(shí)。本實(shí)驗(yàn)提示：1通過(guò)適當(dāng)劑量的間歇的持續(xù)的沖擊應(yīng)用抗腫瘤藥物，可以挑選出持續(xù)生長(zhǎng)的細(xì)胞；2膽管癌細(xì)胞在阿霉素作用下，細(xì)胞內(nèi)的抗腫瘤藥濃度下降，這是腫瘤細(xì)胞在含抗腫瘤藥物的掊養(yǎng)液中生長(zhǎng)繁殖的根底；3阿霉素可以影響細(xì)胞的分裂增殖周期。但該結(jié)論尚需今后進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)得以證實(shí)。參考文獻(xiàn)1叢文銘，吳孟超，陳漢.肝內(nèi)膽管癌多基因變異表型分析J.中華醫(yī)學(xué)雜志，2001，81：271273.2JkbyB.ethdsinenzylgy.NeYrk:AadPress，1979.150.3吳小鵬，王占民，何曉冉.肝門(mén)部膽管癌細(xì)胞系FRH0201的建立及生物學(xué)特性研究J.中華醫(yī)學(xué)雜志,2022,85(25):17841785.4李志偉，王占民，吳小鵬，等.利用裸鼠建立人肝門(mén)部膽管癌肝門(mén)移植模型J.中國(guó)現(xiàn)代普通外科進(jìn)展,2022,74:209.5UhiyaaKkubuN,atanabeT.Establishentandharaterizat