桉木預(yù)水解液中半纖維素多糖分離純化及抗氧化活性研究

1、PAGE 15 -桉木預(yù)水解液中半纖維素多糖分離純化及抗氧化活性研究隨著黏膠纖維以及纖維制品需求量的不斷增加，未來(lái)幾年內(nèi)用于生產(chǎn)再生纖維的溶解漿產(chǎn)量也日益增多1。在生產(chǎn)溶解漿過(guò)程中會(huì)產(chǎn)生大量的預(yù)水解液，如何對(duì)預(yù)水解液進(jìn)行合理利用成為當(dāng)前研究熱點(diǎn)。預(yù)水解液中半纖維素含量豐富，其他如木素、糠醛等含量較少，因此利用半纖維生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品可實(shí)現(xiàn)預(yù)水解液的有效利用2。在預(yù)水解液半纖維素進(jìn)行高附加值利用時(shí)，預(yù)水解液中的雜質(zhì)會(huì)阻礙其有效利用，因此需要對(duì)半纖維素進(jìn)行分離和純化3。離子交換柱層析法在多糖的純化中應(yīng)用十分廣泛4，離子交換柱層析常用的離子交換劑有：離子交換纖維素、離子交換葡聚糖和離子交換樹(shù)脂。其機(jī)理

2、主要是利用物質(zhì)所帶正負(fù)電荷的差異對(duì)管柱上的離子交換劑有不同的親和力，通過(guò)改變淋洗液的離子強(qiáng)度和pH值，使得不同性質(zhì)的多糖依次從層析柱中分離出來(lái)5。半纖維素在眾多領(lǐng)域均具有潛在的應(yīng)用前景6，Anmad等人7從車前子殼中分離出阿拉伯聚木糖，以此為原料制備出了抗菌薄膜。陳婷等人8對(duì)桉木堿性過(guò)氧化性機(jī)械漿（APMP）廢液中的半纖維素進(jìn)行改性后發(fā)現(xiàn)其具有一定的生物活性。汪心娉等人9報(bào)道稱使用低共熔溶劑選擇性處理玉米秸稈，可將其中的半纖維素轉(zhuǎn)化為低聚木糖。但是有關(guān)預(yù)水解液半纖維素多糖分離純化和結(jié)構(gòu)分析的研究報(bào)道較少。本研究通過(guò)對(duì)半纖維素粗多糖分離純化得到純化多糖，對(duì)其單糖成分、結(jié)構(gòu)表征及體外抗氧化活性進(jìn)行

3、研究，以期對(duì)預(yù)水解液的進(jìn)一步研究奠定理論基礎(chǔ)。1 實(shí)驗(yàn)1.1材料及試劑桉木預(yù)水解液（PHL），山東太陽(yáng)紙業(yè)股份有限公司；濃硫酸、氯化鈉、無(wú)水乙醇，分析純，天津市江天化工技術(shù)有限公司；無(wú)水甲醇，色譜純，天津市康科德科技有限公司；DEAE-650M，生化試劑，TOSOH公司；葡萄糖、木糖、阿拉伯糖等，色譜純，Sigma公司。1.2實(shí)驗(yàn)儀器7000B氣質(zhì)聯(lián)用儀，美國(guó)安捷倫公司；T6新世紀(jì)紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，北京普析通用儀器有限責(zé)任；N-1100旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海愛(ài)朗儀器有限公司；FTIR-650傅里葉變換紅外光譜儀，天津港東科技發(fā)展股份有限公司；H3021D高速離心機(jī)，上海知信實(shí)驗(yàn)儀器技術(shù)有限公司；S

4、CIENTZ-10N冷凍干燥機(jī)，寧波新芝生物科技股份有限公司；1530VP掃描電子顯微鏡，德國(guó)LEO公司。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1預(yù)水解液糖組分分析桉木預(yù)水解液原樣以及酸水解后的預(yù)水解液經(jīng)離心機(jī)（8000 r/min，15 min）離心除雜，過(guò)0.22 m濾膜后稀釋到一定濃度，用高效陰離子交換色譜儀測(cè)定糖含量。1.3.2半纖維素粗多糖的制備將離心除雜后的桉木預(yù)水解液原樣進(jìn)行旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，使用濃硫酸酸化預(yù)水解液至pH值2.0，除去木素，靜置過(guò)夜。取上清液以體積比14的比例加入無(wú)水乙醇沉淀（使無(wú)水乙醇含量達(dá)到80%），靜置24 h，8000 r/min離心15 min，收集沉淀物，真空冷凍干燥獲得

5、半纖維素粗多糖（PHLP）。1.3.3半纖維素粗多糖的分離純化將PHLP配制成濃度為1 mg/mL的溶液，取20 mL溶液加樣至DEAE-650M陰離子交換層析柱，依次用蒸餾水、0.2、0.4、0.6 mol/L的NaCl溶液進(jìn)行梯度洗脫，每個(gè)梯度洗脫100管。使用收集器收集，每管收集5 mL。采用苯酚-硫酸法10檢測(cè)各管的多糖含量。洗脫曲線的橫坐標(biāo)為洗脫管數(shù)，縱坐標(biāo)為測(cè)定的多糖含量。將洗脫曲線中各峰對(duì)應(yīng)管數(shù)的洗脫液合并，對(duì)收集的洗脫液減壓濃縮后用去離子水透析除鹽。透析完全后進(jìn)行真空冷凍干燥即得到純化后的2種多糖PHLP-1和PHLP-2。1.3.4葡萄糖醛酸含量測(cè)定釆用硫酸-咔唑法測(cè)定11葡

6、萄糖醛酸含量。精確稱取干燥至恒質(zhì)量的葡萄糖醛酸50 mg，用蒸餾水溶解，定容于100 mL容量瓶中。分別取0、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5和0.6 mL濃度為0.5 mg/mL的葡萄糖醛酸溶液于試管中，分別補(bǔ)加水至1 mL，在冰水浴中加入6 mL濃硫酸?；靹蚝?，在85下水浴20 min，冷卻至室溫，每管加入0.2 mL咔唑溶液（1 g/L，用無(wú)水乙醇配制）。室溫下保持2 h，在530 nm下測(cè)定吸光度。以葡萄糖醛酸濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。葡萄糖醛酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線見(jiàn)圖1。按上述操作步驟測(cè)定吸光度，從而計(jì)算葡萄糖醛酸濃度。圖1葡萄糖醛酸溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 1Stand

7、ard curve of glucuronic acid solution1.3.5單糖組分測(cè)定1.3.5.1標(biāo)準(zhǔn)單糖的衍生化12分別配置1 mg/mL的各單糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，包括葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖、木糖、甘露糖及半乳糖放入試管中。分別取0、40、80、100、250、500 L單糖凍干。在凍干后的標(biāo)準(zhǔn)單糖樣品中，分別加入50 L濃度為20 mg/mL的甲氧基銨鹽酸鹽/吡啶溶液，40水浴80 min后加入80 L的N,O-雙（三甲基硅基）三氟乙酰胺（BSTFA），混勻，40水浴80 min，然后在10000 r/min下離心10 min，取上清液過(guò)0.22 m濾膜后置于進(jìn)樣瓶，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)

8、譜聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析。1.3.5.2純化后的多糖水解及衍生化13稱取2 mg多糖于反應(yīng)釜中，加入5 mL三氟乙酸（2 mol/L 三氟乙酸（TFA），密封后120水解2 h，之后加入無(wú)水甲醇旋蒸除去殘留TFA，最后加入2 mL去離子水，混勻，取100 L混合液于新的離心管中，真空冷凍干燥。按照1.3.5.1標(biāo)準(zhǔn)單糖的衍生化方法處理，反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行氣質(zhì)分析。1.3.5.3氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析條件色譜柱為HP-5氣相色譜柱（30 cm0.32 mm0.25 m）；進(jìn)樣口溫度設(shè)定為250，檢測(cè)器溫度設(shè)定為240，流速1 mL/min；升溫程序：初始溫度為110，保持2 min，以8/min速

9、率升到160，再以2/min速率升到230，最后以5/min的速率升到250，保持2 min。載氣為氮?dú)猓M(jìn)樣量為1 L，分流比為101。1.3.6紅外光譜（FT-IR）測(cè)定稱取純化后的多糖至瑪瑙研缽中，按照1100的比例加入干燥后的溴化鉀做分散劑，研磨成微細(xì)粉末，然后置于模具中，以10 MPa 壓力壓制1 min制片，進(jìn)行紅外光譜測(cè)定。光譜掃描范圍4004000 cm-1，掃描32次，分辨率為4 cm-1，掃描時(shí)扣除H2O和CO2的背景。1.3.7掃描電子顯微鏡（SEM）觀察在金屬樣品臺(tái)上粘貼一塊導(dǎo)電膠用于固定樣品，取適量純化后的多糖樣品置于導(dǎo)電膠上，用洗耳球輕輕吹去浮樣，將金屬樣品臺(tái)放入離

10、子濺射裝置中鍍一層導(dǎo)電金膜，鍍膜后用1530VP掃描電子顯微鏡進(jìn)行觀察。1.3.8PHLP抗氧化活性分析1.3.8.1DPPH自由基清除活性測(cè)定參考馮炘等人14的方法稍作修改，具體步驟為：取不同濃度的多糖溶液（0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL）和VC溶液與1 mL DPPH-乙醇溶液（0.1 mmol/L）混合均勻，避光反應(yīng)30 min后測(cè)定517 nm下的吸光度。以VC為陽(yáng)性對(duì)照。按計(jì)算1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）的清除率。DPPH自由基清除率=(1A1A2A0)100%（1）式中，A1為實(shí)驗(yàn)組吸光度；A2為樣品本底吸光度；A0為空白組吸光度。1.3.8.2A

11、BTS自由基清除活性測(cè)定參考XU等人15的方法稍作修改，具體為：取2,2-聯(lián)氮-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸（ABTS）溶液（7.4 mmol/L）30 mL于50 mL離心管中，加入30 mL過(guò)硫酸鉀溶液（2.6 mmol/L），混合均勻，避光反應(yīng)12 h。然后用蒸餾水稀釋，使其在734 nm下的吸光度約為0.70.02，制成ABTS反應(yīng)液。取1 mL不同濃度的多糖溶液和VC溶液（0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL）與4 mL ABTS反應(yīng)液混合均勻，靜置10 min后測(cè)定734 nm下的吸光度。以VC為陽(yáng)性對(duì)照。按計(jì)算ABTS自由基清除率。ABTS自由基清除率=(1B1

12、B2B0)100%（2）式中，B1為實(shí)驗(yàn)組吸光度；B2為樣品本底吸光度；B0為空白組吸光度。1.3.8.3O2-自由基清除活性測(cè)定參考DONG等人16的方法。具體為：取4.5 mL Tris-HCl緩沖溶液（pH值=8.2，50 mmol/L）于試管中，加入1 mL不同濃度的多糖溶液和VC溶液（0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL），加入0.3 mL經(jīng)25水浴后的鄰苯三酚溶液（10 mmol/L，以10 mmol/L HCl配制）。迅速搖勻后，25水浴5 min，然后加入1 mL HCl（8 mmol/L）終止反應(yīng)，在320 nm處測(cè)定吸光度。以VC為陽(yáng)性對(duì)照。按計(jì)算O2-自由基

13、清除率。O2自由基清除率=(1C1C2C0)100%（3）式中，C1為實(shí)驗(yàn)組吸光度；C2為樣品本底吸光度；C0為空白組吸光度。1.3.8.4OH-自由基清除活性測(cè)定參考CHEN等人17的方法稍作修改，具體為：取不同濃度的多糖溶液及VC溶液（0.2、0.4、0.6、0.8和1.0 mg/mL）于試管中，依次加入1 mL FeSO4溶液（5 mmol/L）、1 mL水楊酸-乙醇溶液（5 mmol/L），最后加入1 mL H2O2溶液（5 mmol/L），混合均勻后，在37下水浴30 min。在510 nm處測(cè)定吸光度，VC為陽(yáng)性對(duì)照。按計(jì)算OH-自由基清除率。OH自由基清除率=(1D1D2D0)1

14、00%（4）式中，D1為實(shí)驗(yàn)組吸光度；D2為樣品本底吸光度；D0為空白組吸光度。2 結(jié)果與討論2.1預(yù)水解液糖組分分析表1為預(yù)水解液中糖組分的含量。由表1可知，預(yù)水解液中單糖主要有阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖、木糖、甘露糖，其中以木糖為主，占單糖含量的57.6%。聚糖以聚木糖為主，占聚糖含量的65.7%。2.2PHLP分離純化分析在陰離子交換層析柱中，氯化鈉溶液中的陰離子（氯離子）將會(huì)與吸附在填料上的多糖競(jìng)爭(zhēng)，而使用蒸餾水和不同濃度的氯化鈉溶液洗脫則可以達(dá)到分離多糖的目的。以DEAE-650M離子交換層析柱對(duì)PHLP進(jìn)行分離純化，得到洗脫曲線如圖2所示。由圖2可以看出，經(jīng)蒸餾水、0.2、0.4、0

15、.6 mol/L NaCl溶液洗脫后，有3個(gè)洗脫峰。第1個(gè)洗脫峰是經(jīng)蒸餾水洗脫出來(lái)的，因?yàn)檫@一部分糖對(duì)填料的親和力較小，吸附能力較弱，所以最先被洗脫出來(lái)18；而另外擁有較強(qiáng)吸附能力的糖組分則隨著洗脫液中陰離子的逐漸增多被洗脫下來(lái)，得到第2個(gè)洗脫峰，當(dāng)用0.4 mol/L的NaCl洗脫時(shí)出現(xiàn)了較小的洗脫峰，因其糖含量較少?zèng)]有純糖的必要，故不再進(jìn)行收集。以蒸餾水和0.2 mol/L NaCl溶液作為洗脫液洗脫下的多糖，分別為PHLP-1中性糖和PHLP-2酸性糖19。測(cè)定PHLP-1的得率為33.9%，PHLP-2的得率為25.5%。PHLP-1和PHLP-2的葡萄糖醛酸含量分別為0.0057、0

16、.081 mg/mL，PHLP-2的糖醛酸含量明顯高于PHLP-1，這與洗脫液鹽濃度的增加可能有極大的關(guān)系，氯化鈉溶液濃度越高，洗脫下來(lái)的多糖側(cè)鏈所帶酸根基團(tuán)越多，多糖的酸性也就越強(qiáng)20。圖2多糖的DEAE-650M洗脫曲線Fig. 2Elution curve of crude polysaccharides on DEAE-650M2.3氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用分析因糖類物質(zhì)的極性較大，難以汽化，因此在使用氣質(zhì)聯(lián)用分析多糖時(shí)，需要對(duì)糖進(jìn)行衍生化處理，使其成為易于汽化的衍生物。本研究采用硅烷化法對(duì)5種單糖標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行衍生化，然后進(jìn)行GC-MS分析，結(jié)果如圖3和圖4所示。從圖3和圖4可以看出，從PHL

17、P-1、PHLP-2中檢測(cè)出5種單糖：阿拉伯糖、木糖、半乳糖、甘露糖和葡萄糖，其摩爾比分別為0.0910.130.070.35和0.110.030.090.08。圖3單糖標(biāo)準(zhǔn)品的GC-MS色譜圖Fig. 3GC-MS chromatogram of monosaccharide standard圖4多糖PHLP-1、PHLP-2的GC-MS色譜圖Fig. 4GC-MS chromatogram of polysaccharides of PHLP-1, PHLP-22.4紅外光譜測(cè)定圖5為PHLP-1和PHLP-2的FT-IR圖。如圖5所示，PHLP-1和PHLP-2具有多糖的典型吸收帶。34

18、00 cm-1處為羥基伸縮振動(dòng)峰，由多糖分子內(nèi)或分子間的OH伸縮振動(dòng)引起；2923 cm-1處是CH鍵的伸縮振動(dòng)吸收峰；在PHLP-2中，1735 cm-1處出現(xiàn)了1個(gè)弱吸收峰，是由酯羰基（COOR）伸縮振動(dòng)引起的，1600 cm-1處共有的強(qiáng)峰為羧酸酯振動(dòng)峰，是由COO的伸縮振動(dòng)引起，說(shuō)明分子含有糖醛酸，表明PHLP-2是酸性多糖21；1400 cm-1處的中強(qiáng)峰代表羧基的存在；1120、1076、1045及620 cm-1處出現(xiàn)的振動(dòng)峰，是由吡喃糖的COC的特征骨架振動(dòng)造成的22；900 cm-1處的振動(dòng)吸收峰，代表2個(gè)多糖是以-糖苷鍵連接的23；但840 cm-1處左右有較弱的吸收信號(hào)，

19、證明PHLP-1中-糖苷鍵的存在24。根據(jù)結(jié)果得知，PHLP-1和PHLP-2均含有吡喃環(huán)和-糖苷鍵，PHLP-1中含有-糖苷鍵，PHLP-2為沒(méi)有-糖苷鍵的酸性多糖。圖5PHLP-1、PHLP-2的FT-IR圖Fig. 5FT-IR spectra of PHLP-1 and PHLP-22.5形貌分析圖6為多糖PHLP-1、PHLP-2的SEM圖。從圖6可以看出，PHLP-1形態(tài)不一，比較雜亂；PHLP-2呈疏松的碎片狀結(jié)構(gòu)，且表面比較光滑。SEM圖直觀的說(shuō)明了PHLP-1和PHLP-2均呈無(wú)序雜亂的結(jié)構(gòu)形態(tài)。2種多糖結(jié)構(gòu)的差異性可能與其單糖組成比例不同有很大的關(guān)系24。圖6多糖PHLP-

20、1、PHLP-2的SEM圖Fig. 6SEM images of polysaeeharides from PHLP-1 and PHLP-22.6抗氧化活性分析2.6.1DPPH自由基清除活性DPPH自由基是一種常見(jiàn)的穩(wěn)定自由基，常被用于評(píng)估抗氧化劑自由基清除能力25。DPPH自由基在溶液中呈現(xiàn)深紫色，并且在517 nm左右有1個(gè)強(qiáng)吸收帶，DPPH自由基的清除機(jī)理是抗氧化劑提供的氫和電子，可以將DPPH自由基還原為黃色，降低其在517 nm處的吸光值26。圖7為PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力。由圖7可以看出，PHLP-1和PHLP-2對(duì)DPPH自由基的清除能力均

21、隨多糖濃度的提高而增強(qiáng)，且呈現(xiàn)明顯的量效依賴關(guān)系。當(dāng)多糖的質(zhì)量濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，PHLP-1、PHLP-2和粗多糖的DPPH自由基清除率分別達(dá)到44.12%、47.79%和20.44%，但是它們清除DPPH自由基的能力明顯低于VC清除DPPH自由基的能力。其清除自由基能力強(qiáng)弱順序?yàn)閂CPHLP-2PHLP-1粗多糖，IC50值依次為0.310-5、0.553、0.603、2.204 mg/mL，IC50值作為半抑制濃度，該值越小，代表自由基清除能力越強(qiáng)20。粗多糖由于其中含有的復(fù)雜成分較多，清除DPPH自由基能力降低，影響了其抗氧化活性27，因此清除能力低于PHLP-1和PHLP-2。

22、而PHLP-2較PHLP-1的清除自由基能力強(qiáng)的原因是PHLP-2為酸性多糖，其糖醛酸含量較高，可以活化異頭碳上的氫原子，從而賦予其更高的抗氧化活性28。圖7PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對(duì)DPPH自由基的清除能力Fig. 7DPPH radical scavenging activities of PHLP-1, PHLP-2 and crude polysaccharides2.6.2ABTS自由基清除活性多糖作為供氫體可以和ABTS自由基反應(yīng)，通過(guò)反應(yīng)后溶液吸光度值降低的大小，從而來(lái)判斷多糖的抗氧化能力29。圖8為PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對(duì)ABTS自由基的清除能力。由圖8可

23、知，PHLP-1、PHLP-2和粗多糖對(duì)ABTS自由基具有一定的清除能力，且隨著濃度的增加，清除率逐漸提高。當(dāng)濃度達(dá)到1 mg/mL時(shí)，PHLP-1、PHLP-2和粗多糖的清除率分別達(dá)到67.62%、71.81%和31.05%，清除ABTS自由基的能力弱于VC清除ABTS自由基的能力。PHLP-2對(duì)ABTS自由基的清除能力最好，其次是PHLP-1，它們的抗氧化能力均大于粗多糖。PHLP-2、PHLP-1、粗多糖對(duì)ABTS自由基清除濃度的IC50值依次為0.580、0.669、3.721 mg/mL。有研究發(fā)現(xiàn)多糖中糖醛酸含量與自由基清除能力呈線性正相關(guān)，這與本研究的實(shí)驗(yàn)結(jié)果相吻合。此外Sun等

24、人32也報(bào)道了糖醛酸含量越高的黑木耳實(shí)體多糖其清除自由基的能力也越強(qiáng)。圖8PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對(duì)ABTS自由基的清除能力Fig. 8ABTS radical scavenging activities of PHLP-1, PHLP-2 and crude polysaccharides2.6.3O2-自由基清除活性O(shè)2-自由基是一種弱氧化劑，相比較OH-自由基和DPPH自由基活性較弱，但其可能會(huì)與羥基分子相互結(jié)合從而造成組織損傷33。圖9為PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對(duì)O2-自由基的清除作用。由圖9可知，PHLP-1、PHLP-2和粗多糖對(duì)O2-自由基有一定的清除能力，但

25、是能力較弱。在00.4 mg/mL之間，清除率的增長(zhǎng)速度較慢，0.40.8 mg/mL之間增速稍快，并逐漸趨于穩(wěn)定。在1 mg/mL時(shí)，PHLP-1、PHLP-2和粗多糖的清除率分別為28.34%、31.10%和7.71%，明顯低于同濃度下VC的清除能力。其清除O2-自由基能力強(qiáng)弱順序?yàn)镻HLP-2PHLP-1粗多糖。PHLP-2、PHLP-1、粗多糖對(duì)O2-自由基清除能力的IC50值依次為2.392、4.095、8145 mg/mL。O2-自由基的清除能力大小與多糖中OH鍵的離解能有關(guān)，OH鍵的離解能越強(qiáng)，清除O2-自由基的能力越低；同時(shí)多糖帶有的羧基、醛基等吸電子基團(tuán)越多，則OH鍵的能量越弱，那么清除O2-自由基的能力也越高。PHLP-2的O2-自由基清除能力比PHLP-1高，其原因可能是PHLP-2為酸性多糖，其糖醛酸含量較多，具有較弱的OH鍵的離解能。圖9PHLP-1、PHLP-2及粗多糖對(duì)O2-自由基的清除能力Fig. 9O2-radical scavenging activity of PHLP-1, PHLP-2 and crude polysaccharides2.6.4OH-自由基清除活性O(shè)H-自由基是較為活潑的自由基之一，OH-自由基的存在可能會(huì)引起機(jī)體生物大分子氧化受損36。圖10為P