β射線內(nèi)照射對(duì)人增生前列腺細(xì)胞凋亡的阻礙

1、射線內(nèi)照射對(duì)人增生前列腺細(xì)胞凋亡的阻礙谷欣權(quán) 曹霞 孔祥波 馬慶杰【摘要】 目的 探討射線內(nèi)照射對(duì)人增生前列腺細(xì)胞凋亡的阻礙。方式 20 例前列腺增生 (BPH)患者隨機(jī)分為 4 組：對(duì)照組未行內(nèi)照射， 3 組照射組于前列腺切除術(shù)前 1，4，7 d 行 90Sr/90Y 射線內(nèi)照射，采納 TUNEL染色、流式細(xì)胞術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)前列腺細(xì)胞凋亡轉(zhuǎn)變。結(jié)果 與對(duì)照組比較， 射線內(nèi)照射后前列腺細(xì)胞凋亡增多，并隨時(shí)刻延長(zhǎng)而增加（ P），對(duì)照組基因組DNA維持完整，射線輻射7 d 后基因組 DNA呈現(xiàn)梯狀帶凋亡改變。結(jié)論射線內(nèi)照射能夠有效誘發(fā)人增生的前列腺細(xì)胞凋亡，進(jìn)而引發(fā)前列腺組織萎縮?！娟P(guān)鍵詞

2、】前列腺增生；電離輻射；細(xì)胞凋亡【 Abstract】ObjectiveTo investigatetheeffectofirradiation on cell apoptosis in human hyperplastic prostatictissues.Methods 20 patientswithbenign prostatichyperplasia(BPH) were dividedinto4 groups accordingto the differenttimetreated with 90Sr/90Y irradiation to prostatic hyperplasia a

3、pplicator before prostatectomy or TURP. The cell apoptosis of humanhyperplastic prostatic tissues was detected by TUNELandflow cytometryand agarose gelCompared with control group, thepercentageofcellapoptosisarose aftertreatedwith90Sr/90Y irradiation and grew more with time going (P. DNA keptcomplet

4、eincontrolgroup while typicalDNAladderband appearedin DNA fragment electrophoresis and the positive cells thatpresentedbrowedwere observed in irradiation7 group.Conclusions rays irradiation can efficiently induce cellapoptosisfrom humanprostatichyperplasiatissueand cause theatrophy of prostatic tiss

5、ue.【 Key words 】Benignprostatichyperplasia； Radiation；Apoptosis細(xì)胞凋亡在前列腺增生（BPH）的發(fā)生、進(jìn)展中具有關(guān)鍵性作用1，2。電離輻射作為一種基因毒素，除可使前列腺組織中與細(xì)胞凋亡相關(guān)的基因和細(xì)胞因子發(fā)生改變外，還能直接或間接引發(fā) DNA損傷而誘發(fā)凋亡 3，4。本實(shí)驗(yàn)采納 TUNEL染色、流式細(xì)胞術(shù)（ FCM）和瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)射線內(nèi)照射對(duì)增生前列腺細(xì)胞凋亡的阻礙，為采納電離輻射醫(yī)治 BPH提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。材料與方式實(shí)驗(yàn)分組 BPH患者 20 例，年齡 5872 歲，病程 213 年，患者隨機(jī)分為 4 組，每組 5 例： 3 個(gè)

6、照射組于前列腺切除術(shù)前 1，4，7 d 行 90Sr/90Y 射線內(nèi)照射，照射劑量為 3050 Gy，對(duì)照組未行內(nèi)照射。各組均行經(jīng)尿道前列腺切除術(shù)或經(jīng)膀胱前列腺摘除術(shù)取得前列腺標(biāo)本。TUNEL 染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡4%多聚甲醛固定前列腺組織46 h，石蠟包埋。切片加蛋白酶K 37消化 5 min，TBS洗滌。加含有TdT和 DIGdUTP的標(biāo)記液 20 l/ 片， 37標(biāo)記 2 h ，TBS洗滌 2 min 3次。加封鎖液 50 l/ 片室溫 30 min，加封鎖液 1100 稀釋生物素化抗地高辛抗體 50 l/ 片， 37反映 30 min，TBS洗滌。加 SABC37 反映 60 min ，T

7、BS洗滌。 DAB顯色 15 min ，蘇木素復(fù)染，常規(guī)脫水、透明、封片。顯微鏡下凋亡陽(yáng)性細(xì)胞核呈深淺不一的棕黃色，正常細(xì)胞核呈藍(lán)色，在每張切片上隨機(jī)選取 10 個(gè)高倍鏡視野， 計(jì)陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，計(jì)算陽(yáng)性反映細(xì)胞數(shù)占細(xì)胞總數(shù)的平均百分比。FCM 檢測(cè)凋亡細(xì)胞 DNA含量 新鮮組織研磨成單細(xì)胞， 70%冷乙醇固定， 4留宿。 600 r/min 離心 5 min ，棄上清，加 mol/L PBS 5 ml ，混勻 1 500 r/min 離心，棄上清，反復(fù) 3 次。用 PBS調(diào)整細(xì)胞濃度 106/ml ，過(guò) 350 目濾網(wǎng)，制成單細(xì)胞懸液，加入濃度 200 g/ml 的 RNase A，3

8、7水浴 30 min，加入低滲熒光染料溶液混勻， 4避光染色 30 min。用流式細(xì)胞儀攝取 PI 熒光，測(cè)凋亡細(xì)胞核百分率。DNA 瓊脂糖凝膠電泳 組織研碎后，離心去上清，加入 10 倍體積的DNA抽提液混勻， 37水浴 1 h，加入蛋白酶 K，50水浴 3 h，12 000 r/min 離心 5 min，用飽和苯酚抽提上清 1 次，再用苯酚 / 氯仿 / 異丙醇（25241） 1ml 充分混勻， 8 500 r/min 離心 5 min ，棄酚相，保留上清，上清中加入 3 mol/L 醋酸鈉和冷乙醇， -20 沉淀留宿。 -10 12 000 r/min 離心 10 min，將沉淀溶于 2

9、0 l TE緩沖液，加入 1 RNA酶， 37保溫 1 h。加 4 l 樣本緩沖液到含有 g/ml 溴化乙錠的 1%2%的瓊脂糖凝膠的樣品孔中，室溫、恒流75 mA，于1TAE緩沖液中電泳 12 h ，紫外燈下觀看實(shí)驗(yàn)結(jié)果。統(tǒng)計(jì)學(xué)處置 數(shù)據(jù)應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)處置，組間比較采納 t 查驗(yàn)。結(jié) 果TUNEL 法染色檢測(cè)前列腺細(xì)胞凋亡 對(duì)照組僅見(jiàn)少數(shù)散在的凋亡細(xì)胞，經(jīng) 90Sr/90Y 射線輻射后細(xì)胞凋亡增多，并隨時(shí)刻而慢慢增加。與間質(zhì)細(xì)胞比較，腺上皮細(xì)胞凋亡加倍明顯，見(jiàn)圖 1。FCM 檢測(cè)凋亡細(xì)胞DNA含量 經(jīng)流式細(xì)胞儀分析凋亡細(xì)胞的DNA含量，可見(jiàn)對(duì)照組凋亡細(xì)胞百分率為（）%，射線輻射可使前

10、列腺組織細(xì)胞周期時(shí)相發(fā)生改變，在二倍體峰前顯現(xiàn)亞二倍體峰即凋亡峰。隨時(shí)刻延長(zhǎng)凋亡細(xì)胞慢慢增多，輻射一、4、 7 d 凋亡細(xì)胞百分率別離為 %， %， %，與對(duì)照組比較不同顯著（P）。DNA 瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)細(xì)胞凋亡 對(duì)照組基因組 DNA維持完整，經(jīng)射線輻射 7 d 后基因組 DNA發(fā)生斷裂，呈現(xiàn)典型的凋亡改變即 DNA 梯形帶（DNALadder），說(shuō)明射線可使細(xì)胞核內(nèi) DNA在核小體連接處發(fā)生斷裂，形成 180200 bp 及其整數(shù)倍的核苷酸片段，見(jiàn)圖 2。圖 1 TUNEL染色檢測(cè)前列腺組織中細(xì)胞凋亡 ( 400)圖 2 DNA瓊脂糖凝膠電泳 3 討 論細(xì)胞凋亡涉及一系列基因表達(dá)、 蛋白

11、質(zhì)和酶的激活， 是細(xì)胞為了適應(yīng)生存環(huán)境而主動(dòng)采取的死亡方式，良性增生的前列腺組織中很少見(jiàn)到細(xì)胞的有絲割裂， DNA的合成也少于正常細(xì)胞，提示 BPH的病因可能不是前列腺細(xì)胞的過(guò)度增殖引發(fā)，而是細(xì)胞凋亡減少所致 5。細(xì)胞凋亡的特點(diǎn)是內(nèi)源性核酸內(nèi)切酶被激活，細(xì)胞染色體 DNA被切割，顯現(xiàn)單鏈或雙鏈缺口， 并產(chǎn)生與 DNA斷點(diǎn)數(shù)量相同的 3 OH結(jié)尾。結(jié)尾脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶可將地高辛標(biāo)記的 dUTP(DIG dUTP)標(biāo)記至 3 OH結(jié)尾，DIG dUTP結(jié)合在 DNA斷點(diǎn)部位，能夠通過(guò)堿性磷酸酶標(biāo)記的抗地高辛抗體反映后，加入顯色底物予以顯示。此種方式靈敏度很高，在凋亡初期就能夠夠檢測(cè)到DNA斷裂。

12、在本實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)原位結(jié)尾脫氧核糖核酸轉(zhuǎn)移酶將地高辛標(biāo)記的 dUTP(DIG dUTP)標(biāo)記至 DNA斷點(diǎn)部位，以顯示細(xì)胞凋亡的程度，陽(yáng)性細(xì)胞核呈棕黃色。實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見(jiàn)對(duì)照組僅見(jiàn)極少數(shù)散在的凋亡細(xì)胞，經(jīng) 90Sr/90Y 射線輻射后凋亡細(xì)胞數(shù)量隨時(shí)刻延長(zhǎng)而慢慢增多， 與間質(zhì)細(xì)胞比較，腺上皮細(xì)胞凋亡加倍明顯，說(shuō)明輻射能使增生的前列腺細(xì)胞發(fā)生凋亡，而前列腺的腺上皮關(guān)于輻射加倍靈敏 6。前列腺細(xì)胞凋亡進(jìn)程中， 由于細(xì)胞漿和染色質(zhì)濃縮、 核裂解，產(chǎn)生凋亡小體，使細(xì)胞的光散射性質(zhì)發(fā)生轉(zhuǎn)變，通過(guò)流式熒光細(xì)胞儀的分析顯示，射線輻射可使前列腺組織細(xì)胞周期時(shí)相發(fā)生改變，凋亡細(xì)胞核在二倍體峰前顯現(xiàn)亞二倍體峰“凋亡峰”

13、 ，隨著輻射后時(shí)刻的延長(zhǎng)，可檢測(cè)到的凋亡細(xì)胞慢慢增多。前列腺細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)的生物化學(xué)特點(diǎn)主若是細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列信號(hào)傳遞反映，有新的 RNA和蛋白質(zhì)合成，核酸內(nèi)切酶被激活，染色質(zhì)DNA被核酸內(nèi)切酶降解，產(chǎn)生假設(shè)干大小不一的多聚核苷酸片段，在瓊脂糖凝膠電泳上呈現(xiàn)階梯狀圖譜 (DNA ladder) ，利用這一特點(diǎn)能夠?qū)?xì)胞凋亡進(jìn)行檢測(cè)。 DNA瓊脂糖凝膠電泳可見(jiàn)對(duì)照組基因組 DNA維持完整，經(jīng)射線輻射 7 d 后基因組 DNA發(fā)生斷裂，呈現(xiàn)典型的凋亡改變即 DNAladder ，說(shuō)明射線可使細(xì)胞核內(nèi)DNA在核小體連接處發(fā)生斷裂，形成180200 bp 及其整數(shù)倍的核苷酸片段。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)TUNEL染

14、色、流式細(xì)胞術(shù)和瓊脂糖凝膠電泳等方式證明，射線內(nèi)照射能夠有效地令人增生的前列腺細(xì)胞凋亡，進(jìn)而引發(fā)前列腺組織萎縮，為采納電離輻射醫(yī)治BPH提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1Kyprianouandterazosinsuppressprostategrowthbyinducing apoptosis：clinical significanceJ.J Urol，2003；169(4) ：15205.2 IacopinoF，Angelucci C，LamaG，etrelatedgene expressioninbenignprostatichyperplasiaandprostatecarcinomaJ.Anticancer Res，2006；26(3A) ：184954.3 MaQJ，Gu XQ，Cao X，et ofbeta radiationon TGFbeta1 andbFGFexpressionin hyperplasticprostatictissues J .AsianJAndrol ，2005；7(1) ：4954.2 和 bax 表達(dá)的阻礙 J. 中國(guó)老年學(xué)雜志， 2003；23(5) ：2812.5 JustulinLA，DelellaFK，F(xiàn)elisbi