菱角皮提取物中鞣酸類化合物的含量測(cè)定及其指紋圖譜研究

1、菱角皮提取物中鞣酸類化合物的含量測(cè)定及其指紋圖譜研究【摘要】目的建立菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣質(zhì)類化合物的HPL含量測(cè)定方法，并對(duì)提取物HPL指紋圖譜條件進(jìn)展研究分析。方法采用反相18柱4.6200，5，甲醇0.5%乙酸水溶液為流動(dòng)相，梯度洗脫，柱溫為25，流速為0.8l/in，在276n下進(jìn)展檢測(cè)。結(jié)果菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣質(zhì)類化合物1,2,6-三沒食子酰-D-葡萄糖的含量為85.7g/g，加樣回收率為92.49%；1,2,4,6-四沒食子酰-D-葡萄糖的含量為244g/g，加樣回收率為96.41%；初步討論了菱角皮提取物的指紋圖譜條件。結(jié)論采用高效液相法測(cè)定菱角皮醋酸乙酯提取物中鞣質(zhì)類化合

2、物的含量，簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確；初步得到別離菱角皮提取物各特征峰的色譜條件，為以后建立指紋圖譜和制定菱角皮藥材及其活性提取物的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了根據(jù)?！娟P(guān)鍵詞】菱；果皮；鞣酸；高效液相色譜；指紋圖譜Abstrat：bjetiveTestablishdeterinatinethdftanninpundsfrbiativeethylaetateextratfthefruitrustfTrapabispinsaRxbbyHPL,andtstudynanalysisnditinsfHPLfingerprintftheextrat.ethdsUsereversephase18lun4.6200，5,deteti

3、nave-lengthat276n,lunteperatureat25,flrateata0.8l/in,andgradientaqueusethanlslutinntaining0.5%aetiaidasabilephase.ResultsThedeterinatinftanniaidpund1,2,6-tri-gallyl-D-glusefrtheextratas85.7g/g,andtheaveragereveriesas92.49%;thedeterinatinftanniaidpund1,2,3,6-tetra-gallyl-D-gluseas244g/g,andtheaverage

4、reveriesas96.41%;apreliinarystudynnditinsfHPLfingerprintfrthebiativeextratasarriedut.nlusinThedeterinatinethdfrthetanninpundsfrethylaetateextratfthefruitrustftheplantbyHPLissiple,fastandaurate.hratgraphinditinsfethylaetateextratftheplantasinitiallybtained,hihprvidethebasisfrestablishentftheHPLfinger

5、printandakingqualitystandardftherudedruganditsbiativeextratfrtheplant.Keyrds：TrapabispinsaRxb;Fruitrust;Tannin;HPL；Fingerprint菱TrapabispinsaRxb，一年生浮水或半挺草本，屬菱科。我國(guó)有15種和11變種，產(chǎn)于全國(guó)各地，以長(zhǎng)江流域亞熱帶地區(qū)分布與栽培最多1。其性甘味涼，無(wú)毒，入腸、胃二經(jīng)，有清熱祛暑、除濕祛風(fēng)、益氣健脾之功2。菱殼，為菱科植物菱或其同屬植物的果皮。其作為藥物始載于?本草綱目拾遺?。據(jù)?中華藥海?所載，其性味微苦、澀，涼，入肺、脾、大腸三經(jīng)，具有

6、解毒療瘡、澀湯止瀉、清化濕熱的成效2。經(jīng)查閱文獻(xiàn)得知，東北菱T.anshuriaFlerv菱角的提取物確實(shí)有一定的抗腫瘤活性35。在我們的前期工作中，選取菱TrapabispinsaRxb的菱角皮作為研究對(duì)象，采用TT法對(duì)菱角皮提取物抗肝癌HepG2細(xì)胞活性成分進(jìn)展活性追蹤，采用液液萃取提取物各極性部位，也證實(shí)了菱角皮醋酸乙酯提取物對(duì)HepG2細(xì)胞有一定的抑制作用；采用反相18柱層析和sephadexLH-20排阻層析別離活性成分，得到兩個(gè)鞣質(zhì)類化合物1,2,6-三沒食子酰-D-葡萄糖1和1,2,4,6-四沒食子酰-D-葡萄糖2，對(duì)該兩個(gè)化合物進(jìn)展了抗癌活性實(shí)驗(yàn)，證實(shí)其對(duì)HepG2細(xì)胞有一定的

7、抑制作用待發(fā)表。此前，有研究說明存在于東北菱菱角中的沒食子酸具有誘導(dǎo)Hela腫瘤細(xì)胞凋亡的作用3。兩個(gè)化合物化學(xué)構(gòu)造式見圖1。本研究將對(duì)菱角皮的醋酸乙酯活性部位中鞣質(zhì)類化合物進(jìn)展HPL定性定量方法研究，旨在建立HPL含量測(cè)定方法，并對(duì)菱角皮醋酸乙酯提取物HPL指紋圖譜條件進(jìn)展研究分析。1儀器與材料1.1儀器AgilentTehnlgies1200Series高效液相色譜儀，電子天平AULABsartriusgrup，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀EYELA。1.2藥材菱殼為從湖南長(zhǎng)沙購(gòu)置的菱角第1批、江西采集的菱角第2批和購(gòu)置的菱角第3批果實(shí)去肉后的硬殼，藥材經(jīng)暨南大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室鑒定為菱Trapabisp

8、insaRxb的果殼。藥材樣品留存于暨南大學(xué)藥學(xué)院生藥學(xué)教研室。1.3標(biāo)準(zhǔn)品1,2,6-三沒食子酰-D-葡萄糖1、1,2,4,6-四沒食子酰-D-葡萄糖2和沒食子酸3對(duì)照品為本實(shí)驗(yàn)室提純物,其中1和2為從該實(shí)驗(yàn)提取物中別離得到，并經(jīng)光譜法鑒定構(gòu)造。甲醇為色譜純，江蘇漢邦科技產(chǎn)品；其余試劑為分析純。2方法與結(jié)果2.1HPL定量分析2.1.1色譜條件色譜柱為依利特18柱4.6200，5；檢測(cè)波長(zhǎng)：276n；柱溫：25；流動(dòng)相：A甲醇，B0.5乙酸水溶液；梯度洗脫條件：010in，10%A20%A；1030in，20%A40%A；3032in，40%A100%A；3242in，100%A；4247i

9、n,10%A；流速：0.8l/in。在上述色譜條件下，化合物1峰的保存時(shí)間在20.55in左右，化合物2峰的保存時(shí)間在25.31in左右，化合物3保存時(shí)間在6.10in左右,并且別離度良好。對(duì)照品、供試品高效液相色譜圖見圖2。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.1.2對(duì)照品溶液的制備精細(xì)稱取化合物10.0023g，置5l容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。配制成0.46g/l的化合物1標(biāo)準(zhǔn)液。精細(xì)稱取0.0041g，化合物2置5l容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。配制成0.82g/l的化合物2標(biāo)準(zhǔn)液。精細(xì)稱取化合物30.0021g，置5l容量瓶中，用甲醇定容至刻度，搖勻。配制成0.46g/l的化合物3標(biāo)準(zhǔn)

10、液。2.1.3供試品制備取菱角皮，粉碎成細(xì)粉，取粉末100g，用5倍量85%乙醇冷浸兩次，第1次為72h，第2次為48h，過濾前超聲兩個(gè)小時(shí)，過濾，合并冷浸液，濾液低溫60減壓回收乙醇，濃縮得菱角殼提取物。將此提取物用適量水100l混懸，再依次用石油醚50l、氯仿50l、醋酸乙酯50l萃取水混懸液各3次，減壓下蒸干溶劑，得醋酸乙酯提取物。2.1.4標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備分別取化合物化合物1，化合物2和對(duì)照品溶液0.2，0.4，0.6，0.8，1.0l，以甲醇定容至10l容量瓶中，制得不同濃度對(duì)照品溶液。精細(xì)汲取20l注入高效液相色譜儀，以對(duì)照品濃度為橫坐標(biāo)，色譜峰面積為縱坐標(biāo)，線性回歸得化合物1方程：

11、Y=58399X-147.85，R=0.9996；化合物2方程：Y=52715X-241.24，R=0.9998。結(jié)果說明化合物1在0.00920.046g/l，化合物2在0,01640.082g/l范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。2.1.5精細(xì)度實(shí)驗(yàn)取化合物1對(duì)照品溶液，精細(xì)汲取20l進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得化合物2峰面積平均值為1980.7，RSD為1.52%。2.1.6穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)分別于0，1，2，4，8，12h對(duì)同一供試品溶液進(jìn)樣測(cè)定，進(jìn)樣量為20l，結(jié)果化合物1平均峰面積為1351.86，RSD為1.79%，化合物2平均峰面積為3622.48，RSD為1.24%，說明供試品溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。2.

12、1.7重復(fù)性實(shí)驗(yàn)精細(xì)稱定菱角皮醋酸乙酯提取物5份各0.0030g于10l容量瓶中，甲醇定容至刻度。精細(xì)汲取20l進(jìn)樣測(cè)定。結(jié)果見表12。表1化合物1峰重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果略表2化合物2峰重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果略2.1.8加樣回收率實(shí)驗(yàn)化合物1加樣回收率實(shí)驗(yàn):精細(xì)稱取化合物10.0026g于25l容量瓶，并精細(xì)稱取0.0021g菱角皮醋酸乙酯提取物于10l容量瓶中，甲醇定容至刻度；再分別汲取該化合物1溶液1l和菱角皮醋酸乙酯提取物溶液5l于10l容量瓶中，甲醇定容至刻度；汲取20l進(jìn)樣測(cè)定，按該法平行測(cè)量3次。結(jié)果見表3。表3化合物1加樣回收率實(shí)驗(yàn)結(jié)果略化合物2加樣回收率實(shí)驗(yàn)：結(jié)果見表4。表4化合物2加樣回收

13、率試驗(yàn)結(jié)果略2.1.9樣品含量測(cè)定精細(xì)稱取0.0030g菱角皮醋酸乙酯提取物于10l容量瓶中，甲醇定容至刻度。精細(xì)汲取20l進(jìn)樣，重復(fù)進(jìn)樣5次，測(cè)得化合物1峰面積平均值為1354.28，RSD為1.52%，化合物1含量為85.7g/g；化合物2峰面積平均值為3622.48，RSD為1.24%,化合物2含量為244g/g。2.2指紋圖譜研究2.2.1色譜條件色譜柱為依利特18柱4.6200，5；檢測(cè)波長(zhǎng)：276n；柱溫：25；流動(dòng)相：A甲醇，B0.5%乙酸水溶液；梯度洗脫條件：015in，10%A20%A；1530in，20%A50%A；3060in，50%A100%A；6065in，100%A

14、；6575in,10%A；流速：0.8l/in。2.2.2方法學(xué)驗(yàn)證重復(fù)性實(shí)驗(yàn):精細(xì)稱定“2.1.3項(xiàng)下制備的菱角皮醋酸乙酯提取物0.0020g各5份于10l容量瓶中，甲醇定容至刻度。精細(xì)汲取20l進(jìn)樣，各主要色譜峰相對(duì)保存時(shí)間和相對(duì)峰面積RSD小于1.5%。穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)：已在“2.1.6項(xiàng)下證明了菱角皮醋酸乙酯提取物溶液在12h內(nèi)穩(wěn)定。精細(xì)度實(shí)驗(yàn)：已在“2.1.5項(xiàng)下證明了該環(huán)境下測(cè)量精細(xì)度良好。指紋圖譜：選取不同產(chǎn)地藥材兩角菱皮和四角菱皮按“2.1.3項(xiàng)下要求制備醋酸乙酯提取物，并分別精細(xì)稱定0.0020g于10l容量瓶中，甲醇定容至刻度，精細(xì)汲取20l進(jìn)樣，所得譜圖與“2.3項(xiàng)下制備的菱角

15、皮醋酸乙酯提取物進(jìn)展比照。結(jié)果見圖36。由圖35可得，3個(gè)藥材都在5.645，22.803，24.314，25.66，45.66，48.391，52.406in左右出現(xiàn)特征色譜峰。分別汲取化合物1，2，3對(duì)照品溶液于該色譜條件下進(jìn)樣，可知5.645in色譜峰為沒食子酸，22.803in色譜峰為化合物1，25.66in色譜峰為化合物2。3討論本研究對(duì)菱角皮抗腫瘤活性部位兩個(gè)鞣酸類主要成分1，2,6-三沒食子酰-b-D-葡萄糖和1,2,4,6-四沒食子酰-b-D-葡萄糖首次進(jìn)展了定量分析方法研究并進(jìn)展了樣品HPL定量分析，首次初步分析了菱角皮醋酸乙酯提取物活性部位的HPL指紋圖譜。結(jié)果說明采用高效液相法可測(cè)定菱角皮醋酸乙酯提取物中兩個(gè)鞣酸類化合物的含量，具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確特點(diǎn)，所建立的HPL提取物指紋圖譜分析方法可用于該活性部位質(zhì)量控制。選用文獻(xiàn)報(bào)道的流動(dòng)相甲醇-0.5%乙酸水溶液進(jìn)展別離，化合物1、2峰形良好，但是大量極性相對(duì)較低的雜質(zhì)吸附在色譜柱上無(wú)法洗脫,嚴(yán)重影響后續(xù)的含量測(cè)定。所以,本實(shí)驗(yàn)采取固相萃取SPE和梯度洗脫步驟,去除這一些雜質(zhì)干擾,保證了后續(xù)HPL指紋圖譜和定量分析順利進(jìn)展。初步得到別離菱角皮提取物各特征峰的色譜條件，也為以后進(jìn)一步完善建立提取物指紋圖譜分析方法和制定菱角皮藥材的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了根據(jù)?！緟⒖嘉?/p>