重組質(zhì)粒的酶切鑒定及PCR實(shí)驗(yàn)1

1、重組質(zhì)粒的酶切鑒定及PCR實(shí)驗(yàn)崔文強(qiáng)201300140012生態(tài)同組者：陳斌 郝書(shū)平摘要 PCR（Polymerase Chain Reaction）即聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，是1986年由Kallis Mullis 發(fā)現(xiàn)。這項(xiàng)技術(shù)已廣泛地應(yīng)用于分子生物學(xué)各個(gè)領(lǐng)域，它不僅可用于基因分離克隆和核酸序列分析，還可用于突變體和重組體的構(gòu)建，基因表達(dá)調(diào)控的研究，基因多態(tài)性的分析等方面。本次實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)學(xué)習(xí)和掌握酶切和PCR反應(yīng)的基本原理和實(shí)驗(yàn)技術(shù)，以驗(yàn)證重組質(zhì)粒插入片段大小。關(guān)鍵詞 酶切；重組質(zhì)粒；插入片段；PCR引言將含有外源DNA的轉(zhuǎn)化子的E.coliDH5菌株進(jìn)行培養(yǎng)，并用試劑盒提取其質(zhì)粒DNA，將所提

2、取的DNA用切pUC19質(zhì)粒的同一種限制性?xún)?nèi)切酶進(jìn)行切割以驗(yàn)證所插入的外源DNA的大小，這就是重組質(zhì)粒酶切鑒定。接著進(jìn)行PCR檢驗(yàn)，PCR是一種利用兩種與相反鏈雜交并附著于靶DNA兩側(cè)的寡核苷酸引物，經(jīng)酶促合成特異的DNA 片段的體外方法。反應(yīng)過(guò)程由高溫變性，低溫退火和延伸等幾步反應(yīng)組成一個(gè)循環(huán)，然后反復(fù)進(jìn)行，使目的的DNA 得以迅速擴(kuò)增。置待擴(kuò)增DNA 于高溫下解鏈成為單鏈DNA 模板，人工合成的兩個(gè)寡核苷酸引物在低溫條件下分別與目的片段兩側(cè)的兩條鏈互補(bǔ)結(jié)合，DNA聚合酶在72將單核苷酸從引物3端開(kāi)始摻入，沿模板53方向延伸，合成DNA 新鏈。由于每一循環(huán)所產(chǎn)生的DNA均能成為下一次循環(huán)的模

3、板，所以PCR 產(chǎn)物以指數(shù)方式增加，經(jīng)2530次周期之后，理論上可增加109倍，實(shí)際上可增加107倍。PCR 技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、省時(shí)、靈敏度高特異性強(qiáng)和對(duì)原始材料質(zhì)量要求低等優(yōu)點(diǎn)，但由于所用的TaqDNA 聚合酶缺乏53核酶外切酶活性，不能糾正反應(yīng)中發(fā)生的錯(cuò)誤核苷酸摻入，估計(jì)每9000個(gè)核苷酸會(huì)導(dǎo)致一個(gè)摻入錯(cuò)誤，但是錯(cuò)誤摻入的堿基有終止鏈延伸的作用傾向，使得錯(cuò)誤不會(huì)擴(kuò)大。實(shí)驗(yàn)材料和方法2.1實(shí)驗(yàn)材料PRC擴(kuò)增儀，瓊脂糖凝膠電泳設(shè)備，移液器，0.2ml薄壁PCR管，凝膠成像儀 ，模板pUC19重組質(zhì)粒，寡核苷酸引物（上游引物M13F，下游引物M13R），TaqDNA聚合酶（TaKaRa，-20貯

4、存），dNTPs（TaKaRa，-20貯存），10PCR反應(yīng)緩沖液（TaKaRa，-20貯存） 高速離心機(jī)，電泳儀，制膠槽，電泳槽，梳子，錐形瓶，量筒，移液槍?zhuān)?，槍尖，Eppendorf管，微量移液器，手套，記號(hào)筆，TAE電泳緩沖液(10)，瓊脂糖，溴化乙錠(EB)， DNA相對(duì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)物DNA Marker kHind，DL5000。2.2實(shí)驗(yàn)方法2.2.1重組質(zhì)粒的酶切、電泳檢測(cè)對(duì)于電泳顯示插入片段在2.0kb以上的重組質(zhì)粒，采用Hind酶切進(jìn)行驗(yàn)證。大片段或高產(chǎn)量的重組質(zhì)粒推薦的反應(yīng)體系（10l體系）如下：表1質(zhì)粒酶切反應(yīng)體系成分體積（l）*4dd H2O6.22610Buffe

5、r（含Mg2+）1.04Re-Puc192.0Hind（15U/l）0.83.2共計(jì)10.08L/tube輕彈混勻后，短暫離心，于37 孵育1.5hr后，保存于 -20，備電泳檢測(cè)。 取酶切產(chǎn)物10 ul，加入2 ul 10loading buffer，混勻后點(diǎn)樣。 取重組質(zhì)粒2 ul，加入4L dd H2O，1 ul 10loading buffer，混勻后點(diǎn)樣。以 DNA/HindIII為Marker，點(diǎn)樣順序如表2。100V恒壓電泳約40min。電泳結(jié)束EB染色10min，水洗后紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表2重組質(zhì)粒酶切上樣順序泳道123415161718樣品/HindpUC19/HindR

6、p1-1rp1-1 HindRp7-1Rp7-1 HindpUC19/Hind/Hind樣量L10510101010510作用M對(duì)照對(duì)照對(duì)照M對(duì)照2.2.2重組質(zhì)粒的PCR驗(yàn)證對(duì)于電泳顯示插入片段在2.0kb以下的重組質(zhì)粒，采用PCR進(jìn)行驗(yàn)證。引物此次重組用到的載體是pUC19，限制性?xún)?nèi)切酶為Hind ，所以選擇Hind 酶切位點(diǎn)兩側(cè)一定距離的序列制作引物。由于載體pUC19上兩引物間序列的長(zhǎng)度是150bp，所以PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的長(zhǎng)度（bp）=150+插入片段的長(zhǎng)度。實(shí)驗(yàn)中首先建立反應(yīng)體系：表3 PCR引物引物名稱(chēng)引物序列5 3引物長(zhǎng)度(mers)Tm()M13F(-47)CGCCAGGGTTT

7、TCCCAGTCAC GAC2464.7M13R(-48)GAGCGGATAACAATTTCACACAGG2457.9表4 PCR反應(yīng)體系編號(hào)組分加量（ul）1dd H2O13.2210Buffer（含Mg2+）2.03dNTP（2.5 mM each）1.64M13F（10M）15M13R（10M）16模板（1-10ng/l）1.07Taq酶（5u/l） 0.2總體積20.0建立體系后將加好樣的PCR管進(jìn)行標(biāo)記，放入PCR儀中，設(shè)定反應(yīng)基本參數(shù)如表5所示表5 PCR反應(yīng)程序項(xiàng)目溫度/ 時(shí)間預(yù)變性943min變性9425cycles30s25cycles復(fù)性5830s延伸7275s終延伸721

8、0min保存42hr預(yù)變性：讓DNA雙鏈充分解離,然后第一次退火過(guò)程時(shí)候引物可以盡量多的結(jié)合到模版上面這主要是為了保險(xiǎn)起見(jiàn)，使模板DNA的二級(jí)結(jié)構(gòu)充分打開(kāi)。變性：通過(guò)加熱使DNA雙螺旋的氫鍵斷裂，雙鏈解離形成單鏈DNA。復(fù)性：當(dāng)溫度突然降低時(shí)由于模板分子結(jié)構(gòu)較引物要復(fù)雜的多，而且反應(yīng)體系中引物DNA量大大多于模板DNA，使引物和其互補(bǔ)的模板在局部形成雜交鏈，而模板DNA雙鏈之間互補(bǔ)的機(jī)會(huì)較少。延伸：在DNA聚合酶和4種脫氧核糖核苷三磷酸底物及鎂離子存在的條件下 ， 5-3的聚合酶催化以引物為起始點(diǎn)的DNA鏈延伸反應(yīng)。終延伸：循環(huán)完成后 使PCR反應(yīng)完全以提高擴(kuò)增產(chǎn)量，在用普通Taq酶進(jìn)行PCR

9、擴(kuò)增時(shí)在產(chǎn)物末端加A尾的作用，可以直接用于TA克隆的進(jìn)行。PCR結(jié)束之后對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)，用1%的瓊脂糖凝膠電泳：20ulPCR產(chǎn)物中加3.0ul 10loading buffer，混合均勻，取5ul 點(diǎn)樣，上樣順序如表6。以DL2000和DL5000為Marker。100V恒壓電泳約40min。電泳結(jié)束EB染色10min，水洗后紫外燈下觀察實(shí)驗(yàn)結(jié)果。表6 PCR產(chǎn)物上樣順序泳道123891011樣品DL20001-11-24-14-2DL5000DL2000樣量L51010101055作用MarkerMarkerMarker實(shí)驗(yàn)結(jié)果和分析3.1實(shí)驗(yàn)結(jié)果3.1.1重組質(zhì)粒的酶切電泳結(jié)果將重組

10、質(zhì)粒酶切之后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，成像如圖1 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18圖1重組質(zhì)粒酶切凝膠電泳成像圖第3、4泳道是我們組的結(jié)果，分別是重組質(zhì)粒和酶切后的重組質(zhì)粒，因?yàn)椴迦肫魏苄。悦盖惺墙栌玫?組的質(zhì)粒。由泳道3可以看出重組質(zhì)粒大小與DNA/Hind中4361的條帶大致平齊，推測(cè)其大小為4300，泳道4中自上而下一共五條帶，最上面的條帶 ，第2條帶是切開(kāi)的pUC19載體，下面三條分別是酶切開(kāi)的大小為2027、564和125bp的片段。3.1.2重組質(zhì)粒的PCR驗(yàn)證結(jié)果瓊脂糖電泳展示的克隆片段的PCR擴(kuò)增結(jié)果如下圖： 1 2 3

11、4 5 6 7 8 9 10 11 圖2 重組質(zhì)粒的PCR驗(yàn)證結(jié)果我們組的結(jié)果是第2、3泳道，與DL2000marker對(duì)比來(lái)看，大小比250bp的條帶稍大，減去兩引物間序列的長(zhǎng)度150bp，可以得出插入片段的大小是125bp。討論4.1注意事項(xiàng)（1） 限制性?xún)?nèi)切酶的酶切反應(yīng)屬于微量操作技術(shù)，無(wú)論是DNA樣品還是酶的用量都極少，必須嚴(yán)格注意吸樣量的準(zhǔn)確性并確保樣品和酶全部加入反應(yīng)體系；（2） 酶切反應(yīng)的所有塑料制品（Eppendorf管、吸頭等）必須是新的，并經(jīng)過(guò)高溫滅菌，操作時(shí)打開(kāi)使用，操作過(guò)程不要求無(wú)菌，但要注意手和空氣中雜酶的污染，因此要求環(huán)境干凈，戴手套操作，盡量減少走動(dòng)，縮短Eppe

12、ndorf管的開(kāi)蓋時(shí)間。（3） 注意酶切加樣的順序，一般先加重蒸水，其次加緩沖液和DNA，最后加酶。前幾步要把樣品加到管底的側(cè)壁上，加完后用力將其甩到管底，而酶液要在加入前從-20冰箱取出，酶管放置在冰上，取酶液時(shí)洗頭應(yīng)從表面吸取，防止由于插入過(guò)深而使吸頭外壁沾染過(guò)多的酶液，取出的酶液應(yīng)立即加入反應(yīng)混合也得液面以下，并充分混勻。酶液使用完畢后立即放回冰箱，防止酶的失活。（4）Tm值(解鏈溫度)=4(G+C)2(A+T)，復(fù)性溫度=Tm值-(510)，本實(shí)驗(yàn)兩個(gè)引物的Tm分別為64.7，57.9，選用退火溫度為58，這是因?yàn)樵赥m值允許范圍內(nèi)， 選擇較高的復(fù)性溫度可大大減少引物和模板間的非特異性

13、結(jié)合， 提高PCR反應(yīng)的特異性。4.2 PCR反應(yīng)的要素PCR反應(yīng)五要素：參加PCR反應(yīng)的物質(zhì)主要有五種即：引物(PCR引物為DNA片段，細(xì)胞內(nèi)DNA復(fù)制的引物為一段RNA鏈）、酶、dNTP、模板和緩沖液（其中需要Mg2+）。（1）PCR引物設(shè)計(jì)PCR反應(yīng)中有兩條引物，即5端引物和3引物。設(shè)計(jì)引物時(shí)以一條DNA單鏈為基準(zhǔn)（常以信息鏈為基準(zhǔn)），5端引物與位于待擴(kuò)增片段5端上的一小段DNA序列相同；3端引物與位于待擴(kuò)增片段3端的一小段DNA序列互補(bǔ)。引物設(shè)計(jì)的基本原則引物長(zhǎng)度：15-30bp，常用為20bp左右。引物堿基：G+C含量以40-60%為宜，G+C太少擴(kuò)增效果不佳，G+C 過(guò)多易出現(xiàn)非特

14、異條帶。ATGC最好隨機(jī)分布，避免5個(gè)以上的 HYPERLINK /lemma/ShowInnerLink.htm?lemmaId=267678 t /_blank 嘌呤或 HYPERLINK /lemma/ShowInnerLink.htm?lemmaId=5478759 t /_blank 嘧啶核苷酸的成串排列參照。引物內(nèi)部不應(yīng)出現(xiàn)互補(bǔ)序列。兩個(gè)引物之間不應(yīng)存在互補(bǔ)序列，尤其是避免3 端的互補(bǔ)重疊。引物與非特異擴(kuò)增區(qū)的序列的 HYPERLINK /lemma/ShowInnerLink.htm?lemmaId=101391&ss_c=ssc.citiao.link t /_blank 同源

15、性不要超過(guò)70%，引物3末端連續(xù)8個(gè)堿基在待擴(kuò)增區(qū)以外不能有完全互補(bǔ)序列，否則易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增。引物3端的堿基，特別是最末及倒數(shù)第二個(gè)堿基，應(yīng)嚴(yán)格要求配對(duì)，最佳選擇是G和C。引物的5 端可以修飾。如附加 HYPERLINK /lemma/ShowInnerLink.htm?lemmaId=478502&ss_c=ssc.citiao.link t /_blank 限制酶位點(diǎn)，引入突變位點(diǎn)，用 HYPERLINK /lemma/ShowInnerLink.htm?lemmaId=1482450 t /_blank 生物素、熒光物質(zhì)、地 HYPERLINK /lemma/ShowInnerLin

16、k.htm?lemmaId=413528 t /_blank 高辛標(biāo)記，加入其它短序列，包括 HYPERLINK /lemma/ShowInnerLink.htm?lemmaId=7605505&ss_c=ssc.citiao.link t /_blank 起始密碼子、 HYPERLINK /lemma/ShowInnerLink.htm?lemmaId=7540512&ss_c=ssc.citiao.link t /_blank 終止密碼子等。（2）模板的制備聚合酶鏈鎖反應(yīng)PCR的模板可以是DNA，也可以是RNA。模板的取材主要依據(jù)PCR的擴(kuò)增對(duì)象，標(biāo)本處理的基本要求是除去雜質(zhì)，并部分純化標(biāo)

17、本中的核酸。多數(shù)樣品需要經(jīng)過(guò)SDS和 HYPERLINK /lemma/ShowInnerLink.htm?lemmaId=191867 t /_blank 蛋白酶K處理。難以破碎的細(xì)菌，可用 HYPERLINK /lemma/ShowInnerLink.htm?lemmaId=224395 t /_blank 溶菌酶加EDTA處理。所得到的粗制DNA，經(jīng)酚、氯仿 HYPERLINK /lemma/ShowInnerLink.htm?lemmaId=362187&ss_c=ssc.citiao.link t /_blank 抽提純化，再用乙醇沉淀后用作PCR反應(yīng)模板。（3）反應(yīng)的控制PCR反應(yīng)

18、的緩沖液 提供合適的酸堿度與某些離子鎂離子濃度 總量應(yīng)比dNTPs的濃度高，常用1.5mmol/L底物濃度 dNTP以等 HYPERLINK /lemma/ShowInnerLink.htm?lemmaId=286714 t /_blank 摩爾濃度配制，20200umol/LTaqDNA聚合酶 2.5U(100ul）引物 濃度一般為0.1 0.5umol/L反應(yīng)溫度和循環(huán)次數(shù)變性溫度和時(shí)間 95，30s HYPERLINK /lemma/ShowInnerLink.htm?lemmaId=580164&ss_c=ssc.citiao.link t /_blank 退火溫度和時(shí)間 低于引物Tm值5 左右，一般在4555延伸溫度和時(shí)間 72，1min/kb(10kb內(nèi)）Tm值=4(G+C) +2(A+T)循環(huán)次數(shù) ：一般為25 30次。 HYPERLINK /lemma/ShowInnerLink.htm?lemmaId=73787730&ss_c=ssc.citiao.link t /_blank 循環(huán)數(shù)決定PCR擴(kuò)增的產(chǎn)量。模板初始濃度低，可增加循環(huán)數(shù)以便達(dá)到有效的 擴(kuò)增量。但循環(huán)數(shù)并不是可以無(wú)限增加的。一般循環(huán)數(shù)為30個(gè)左右，循環(huán)