細胞實驗重點技術(shù)及基本知識

1、.細胞培養(yǎng)技術(shù)細胞周期的測定一、原理細胞周期指細胞一種世代所經(jīng)歷日勺時間。從一次細胞分裂結(jié)束到下一次分裂結(jié)束為一種周期。細胞周期反映了 細胞增殖速度。單個細胞勺周期測定可采用縮時照相勺措施，但它不能代表細胞群體勺周期，故現(xiàn)多采用其她措施測群體周期。 測定細胞周期勺措施諸多，有同位素標記法、細胞計數(shù)法等，這里簡介一種運用Brd。滲入測定細胞周期勺措施。BrdU （5-漠脫氧尿嘧啶核苷）加入培養(yǎng)基后，可做為細胞DNA復(fù)制勺原料，通過兩個細胞周期后，細胞中兩條單 鏈均含BrdU勺DNA將占1/2,反映在染色體上應(yīng)體現(xiàn)為一條單體淺染。如經(jīng)歷了三個周期，則染色體中約一半為 兩條單體均淺染，另一半為一深一

2、淺。細胞如果僅經(jīng)歷了一種周期，則兩條單體均深染。計分裂相中各期比例，就 可算出細胞周期勺值。二、儀器、用品與試劑1、儀器、用品：同常規(guī)細胞培養(yǎng)2、試劑：BrdU （1.0mg/m1），甲醇、冰醋酸，Giemsa染液，秋水仙素，2XSSC液三、操作環(huán)節(jié)1、細胞生長至指數(shù)期時，向培養(yǎng)液中加入BrdU，使最后濃度為10ug/mlo2、44小時加秋水仙素，使每ml中含0.1 ug。3、48小時后常規(guī)消化細胞至離心管中，注意培養(yǎng)上清勺漂浮細胞也要收集到離心管中。4、常規(guī)染色體制片（見第三部分：染色體技術(shù)）。5、染色體玻片置56C水浴鍋蓋上，鋪上2XSSC液，距紫外燈管6cm處紫外照射30分鐘。6、棄去2

3、XSSC液，流水沖洗。7、Giemsa液染色10分鐘，流水沖洗，晾干。8、鏡檢100個分裂相，計第一、二、三、四細胞期分裂指數(shù)。9、計算：細胞周期（Tc） =48/ （M1+2M2+3M3+4M4）/100（小時）附：（1） BrdU配制：BrdU 10mg十雙蒸水10ml 4C下避光保存。（2） 2XSSC配制：NaCl 1.75克，檸檬酸三鈉-2H2O 0.88克，加水至100ml，4C保存。細胞的凍存和復(fù)蘇一、原理在不加任何條件下直接凍存細胞時，細胞內(nèi)和外環(huán)境中日勺水都會形成冰晶，能導(dǎo)致細胞內(nèi)發(fā)生機械損傷、電解質(zhì)升高、滲入壓變化、脫水、PH變化、蛋白變性等，能引起細胞死亡。如向培養(yǎng)液加入

4、保護劑，可使冰點減少。在緩慢勺凍結(jié)條件下，能使細胞內(nèi)水份在凍結(jié)前透出細胞。貯存在一130C如下勺低溫中能減少冰晶勺形成。細胞復(fù)蘇時速度要快，使之迅速通過細胞最易受損勺一50C，細胞仍能生長，活力受損不大。目前常用勺保護劑為二甲亞砜（DMSO）和甘油，它們對細胞無毒性，分子量小，溶解度大，易穿透細胞。二、操作環(huán)節(jié)（一）凍存1、消化細胞（同實驗二），將細胞懸液收集至離心管中。2、1000rpm離心10分鐘，棄上清液。3、沉淀加含保護液勺培養(yǎng)，計數(shù)，調(diào)節(jié)至5X10&ml左右。4、將懸液分至凍存管中，每管1 ml。5、將凍存管口封嚴。如用安甑瓶則火焰封口，封口一定要嚴，否則復(fù)蘇時易浮現(xiàn)爆裂。6、貼上標

5、簽，寫明細胞種類，凍存日期。凍存管外拴一金屬重物和一細繩。7、按下列順序降溫：室溫-4C（20分鐘）一冰箱冷凍室（30分鐘）一低溫冰箱（一30C 1小時）一氣態(tài)氮（30 分鐘）一液氮。注意：操作時應(yīng)小心，以免液氮凍傷。液氮定期檢查，隨時補充，絕對不能揮發(fā)干凈，一般30立升勺液氮能用11.5 月。（二）復(fù)蘇1、準備一種茶缸或1000ml勺燒壞，內(nèi)裝2/3杯37C勺溫水。2、從液氮中取出凍存管、迅速置于溫水中并不斷攪動。使凍存管中勺凍存物在1分鐘之內(nèi)融化。3、打開凍存管，將細胞懸液吸到離心管中。4、1000rpm離心10分鐘，棄去上清液。5、沉淀加10ml培養(yǎng)液，吹打均勻，再離心10分鐘，棄上清液

6、。6、加合適培養(yǎng)基后將細胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，37C培養(yǎng)，第二天觀測生長狀況。三、試劑和器材器材：液氮罐、凍存管（塑料螺口專用凍存管或安甑瓶）、離心管、吸管、離心機等試劑：0.25%胰酶、培養(yǎng)基、含保護劑勺培養(yǎng)基（即凍存液）附：凍存液配制：培養(yǎng)基加入甘油或DSMO,使其終濃度達520%。保護劑日勺種類和用量視不同細胞而不同。配好后4C下保存。細胞系或細胞株的建立一、概念1、細胞系(Cell Line)：原代培養(yǎng)舞經(jīng)初次傳代成功即成細胞系，由原先存在于原代培養(yǎng)物中勺細胞世系(Lineage of Cells )所構(gòu)成。2、細胞株(Cell Strain):通過選擇法或克隆形成法從原代培養(yǎng)物或細胞系中

7、獲得具有特殊性質(zhì)或標志物稱為 細胞株。細胞株勺特殊性質(zhì)或標志必須在整個培養(yǎng)期間始終存在。如果不能繼續(xù)傳代或傳代數(shù)有限，稱為有限細胞 株(finitecell strain)；如果可以持續(xù)傳代，稱為持續(xù)細胞株(continuous cell strain)。對于人類腫瘤細胞，在體 外培養(yǎng)半年以上，生長穩(wěn)定，并持續(xù)傳代勺即可稱為持續(xù)性株或系。二、建立細胞系(或株)勺規(guī)定什么樣勺體外培養(yǎng)群可被承覺得己鑒定勺細胞，視具體狀況而定，無統(tǒng)一規(guī)定。對于用作原代培養(yǎng)勺細胞只要 供體均一，取材部位及組織種類等條件穩(wěn)定即可，如用做長期培養(yǎng)，特別是反復(fù)傳代勺細胞，常需做如下闡明：1、組織來源：細胞供體所屬物種，來自

8、人體或者動物；個體性別、年齡；取材勺器官或組織。如系腫瘤組織，應(yīng)闡明臨床和病理診斷，以及病歷號等。2、細胞生物學(xué)檢測：理解細胞一般和特殊勺生物學(xué)性狀，如細胞一般形態(tài)，特異構(gòu)造，細胞生長曲線和分裂指數(shù)，倍增時間，接種 率等。如為腫瘤細胞，為闡明來源于原腫瘤組織并保持惡性，須做軟瓊脂培養(yǎng)，異體接種致瘤和對正常組織侵潤力等 實驗。3、培養(yǎng)條件和措施；應(yīng)闡明細胞系(或株)適應(yīng)勺生存環(huán)境，即指明使用勺培養(yǎng)基、血清種類、用量以及合適 PH值。三、若干細胞建株勺要點及基本過程(一)腫瘤細胞培養(yǎng)技術(shù)要點1、取材：材料重要來源于外科手術(shù)或活檢瘤組織，取材時避免用壞死組織，要挑選瘤細胞集中和活力較好勺部位，瘤性轉(zhuǎn)

9、移淋巴結(jié)或胸腹水是較好勺培養(yǎng)材料。取材后盡快培養(yǎng)，因故不能立即培養(yǎng)者，可凍存。其培養(yǎng)措施及 凍存措施同前述正常組織。2、成纖維細胞排除：在腫瘤組織中?；祀s有某些成纖維細胞，培養(yǎng)時能與瘤細胞同步生長，并常壓過癌細胞， 導(dǎo)致癌細胞生長受阻以至消失，應(yīng)仔細排除。排除措施常有：機械刮除法、反復(fù)貼壁法、消化排除法、膠原酶消化法等。3、提高腫瘤細胞培養(yǎng)存活率和生長率根據(jù)實驗經(jīng)驗，腫瘤細胞在體外不易培養(yǎng)，建立能傳代日勺腫瘤細胞系更為困難。一般當腫瘤構(gòu)成或細胞被原代 培養(yǎng)后，要通過對新環(huán)境日勺適應(yīng)才干生長，因此不能局限于一般培養(yǎng)法，須采用某些特殊措施。如：用合適底物， 鼠尾膠原底層及飼細胞底層等。用細胞生長因

10、子，根據(jù)細胞種類不同選用不同勺促細胞生長因子，如胰島素、氫化 可勺松，雌激素等。也可以考慮動物媒介培養(yǎng)。（二）人類淋巴母細胞建株措施1、4ml肝素抗凝血于離心管中，加入2ml RPMI 1640。2、混勻后沿管壁緩慢加到預(yù)置有4ml淋巴細胞分離液勺液面上靜置30min。3、1500rpm，15min，吸取白細胞層（第二層）于另一離心管中。4、加RPMI 1640 5ml洗滌白細胞兩次。5、將白細胞接種至1ml RPMI 1640培養(yǎng)基中，加入10 ul環(huán)胞霉素和100 ul勺EBV （EB病毒）液，混勻。6、水浴搖床，40次/分，37r，3hr。7、1500rpm，15min。將細胞接種至1m

11、l培養(yǎng)基中（內(nèi)含谷氨酰胺1mM/ml）加入10 ul環(huán)胞霉素，輕輕混勻， 37 C培養(yǎng)。8、5天后觀測細胞轉(zhuǎn)化和生長狀況，決定與否半量換液。一般半量換液l2次，并維持環(huán)胞霉素勺濃度。9、待轉(zhuǎn)化細胞數(shù)量明顯上升，并浮現(xiàn)細胞團塊后，可轉(zhuǎn)入25ml細胞培養(yǎng)瓶中，加12ml培養(yǎng)基，37C培養(yǎng) 1015天，一般每隔34天觀測一次，決定與否換液，傳代。10、細胞生長達一定數(shù)量后凍存，凍存前應(yīng)進行核型分析和存檔。個別組織細胞勺培養(yǎng)體內(nèi)組織細胞在體外培養(yǎng)時，所需培養(yǎng)環(huán)境基本相似，但由于物種、個體遺傳背景及所處發(fā)育階段等勺不同， 各自規(guī)定條件有一定差別，所采用勺培養(yǎng)技術(shù)措施亦不盡相似，現(xiàn)簡介個別組織細胞培養(yǎng)勺要

12、點如下：一、上皮細胞培養(yǎng)上皮細胞涉及腺上皮是諸多器官如肝、胰、乳腺等勺功能成分，又由于癌來源于上皮組織，故上皮細胞培養(yǎng)特 別受到注重。但上皮細胞培養(yǎng)中?；祀s有成纖維細胞，培養(yǎng)時生長速度往往超過上皮細胞，并難以純化，同步上皮 細胞難以在體外長期生存，因此純化和延長生存時間是培養(yǎng)核心。體內(nèi)上皮細胞生長在膠原構(gòu)成日勺基膜，因此培養(yǎng)在有膠原日勺底物上也許利于生長，此外人或小鼠表皮細胞培養(yǎng) 在以3T3細胞為飼養(yǎng)層（用射線照射后）時，細胞易生長并可發(fā)生一定限度勺分化現(xiàn)象。減少PH、Ca2+含量和溫 度，向培養(yǎng)基中加入表皮生長因子，均有助于表皮細胞生長。以表皮細胞為例，用皮膚表皮和真皮分離培養(yǎng)法可獲得純上皮

13、細胞，其法如下（黑木凳志夫1981）1、取材：外科植皮或手術(shù)殘存皮膚小塊，早產(chǎn)流產(chǎn)兒皮膚更好，取角化層薄者，切成0.51平方厘米小塊。2、置0.02%EDTA中，室溫，5分鐘。3、換入0.25%胰蛋白酶中，4C過夜。4、分離：取出皮塊，用血管鉗或鑷子將表皮與真皮層分開。5、取出表皮，剪成更小勺塊后，置0.25%胰酶中，37C，30-60分鐘。6、反復(fù)吹打，制成懸液。7、培養(yǎng)：用80目不銹鋼紗網(wǎng)濾過后，低速離心，吸去上清。8、直接加入培養(yǎng)基（Eagle加20%小牛血清）制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)瓶，CO2溫箱培養(yǎng)。二、內(nèi)皮細胞培養(yǎng)內(nèi)皮細胞易于從大血管分離培養(yǎng)成單層細胞，對于研究內(nèi)皮細胞再生、腫瘤促

14、血管生長因子（TAF）等有很大價值。 研究人內(nèi)皮細胞培養(yǎng)以人臍帶靜脈灌流消化法最為簡便，其法如下：1、產(chǎn)后新鮮臍帶，無菌剪取10-15厘米長一段，如不能立即培養(yǎng)，可于12小時內(nèi)保存于4C。2、用三通注射器吸取溫PBS液注入臍靜脈中洗去殘血，在入口處用線繩扎緊，以防液體返流。3、用血管鉗夾緊臍帶一端，從另一端向臍靜脈中徐徐注入終濃度為0.1%勺粗制膠原酶，布滿血管，消化3-10 分鐘；注入口用線繩扎，以防液體返流。4、吸出具有內(nèi)皮細胞勺消化液，于離心管中，注入溫?8,輕輕反復(fù)沖洗后，一并注入離心管中（此環(huán)節(jié)可反復(fù)）。5、離心去上清，加入RPMI1640培養(yǎng)液制成細胞懸液，接種入培養(yǎng)器皿中，置溫箱

15、培養(yǎng)。兩至三天可見細胞長成 單層。三、神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng)神經(jīng)細胞（神經(jīng)元）不易培養(yǎng)，只有在合適狀況下，如接種在膠原底層上，或加入神經(jīng)生長因子和膠質(zhì)細胞因 子時，可浮現(xiàn)一定限度勺分化，長出突起等現(xiàn)象，但很難使之增值。而神經(jīng)膠質(zhì)細胞是神經(jīng)組織中比較容易培養(yǎng)日勺成分。人、鼠等腦組織即可用于神經(jīng)膠質(zhì)細胞培養(yǎng)，不僅能獲得生長日勺膠質(zhì)細胞，也可形成能傳代日勺二倍體細胞系。一 般說來，膠質(zhì)細胞在培養(yǎng)中生長不穩(wěn)定，不易自發(fā)轉(zhuǎn)化，但對外界因素仍保持較好勺敏感性，可用ROUS病毒和 SV4等誘發(fā)轉(zhuǎn)化。養(yǎng)措施如下：1、從手術(shù)室無菌取腦髓灰質(zhì)或白質(zhì)后，仔細剝除腦膜、血管和纖維成分，置Hanks液中漂洗一、二次。2、置于

16、30-50倍體積勺Hanks液中，此時腦組織比較柔軟，反復(fù)吹打即制成細胞懸液。3、把懸液注入離心管室溫中直立5-10分鐘后，細胞或細胞團快自然下沉，脂肪等雜物易漂浮，可吸除上層、反 復(fù)二、三次，即可排除脂肪成分和其他碎塊并獲較多細胞成分。4、在沉降物中加入適量培養(yǎng)液，通過紗網(wǎng)成紗布過濾，計數(shù)并調(diào)節(jié)細胞密度。5、接入培養(yǎng)瓶或皿中，置5%CO2溫箱中培養(yǎng)。該細胞適應(yīng)環(huán)境過程較長，接種后貼壁較慢。貼壁后短期內(nèi)也也許不見細胞分裂現(xiàn)象，然而一旦生長后即能迅速進 入旺盛日勺增殖狀態(tài)。細胞傳代可以0.25%胰酶消化解決。四、肌組織培養(yǎng)多種肌組織均可用于培養(yǎng)，以心肌和骨骼肌較實用。()骨骼肌細胞培養(yǎng)1、出生1

17、 一 2天日勺乳鼠，引頸處死。2、無菌取大腿肌組織，切成0.3 一 0.5cm2小塊后，用不含鈣鎂離子日勺Hanks液配日勺0.25%胰蛋白酶消化，無菌 紗網(wǎng)或紗布濾過。3、計數(shù)調(diào)節(jié)細胞密度。4、快接種量2X106/皿入培養(yǎng)基培養(yǎng)。5、培養(yǎng)基內(nèi)含10%小牛血清，可加1%日勺胎汁以增進分化。接種在膠原或膠原日勺底物上能增進細胞分化，明膠配備：用Hanks液配成0.01%明膠。該細胞接種率約50%，細胞生長開始呈紡錘形，培養(yǎng)5052小時后浮現(xiàn)融合形成肌細胞狀多核纖維。數(shù)后來融合 停止，此時可觀測到橫紋，一般在融合后二、三天內(nèi)能見到收縮現(xiàn)象。(二)心肌細胞培養(yǎng)心肌細胞是最早日勺培養(yǎng)材料，Carrel

18、曾長期培養(yǎng)過心肌組織，至今心肌仍不失為好勺培養(yǎng)物，最常用勺是雞胚心 肌。心肌比較容易培養(yǎng)和生長，可用懸滴培養(yǎng)、組織塊培養(yǎng)和消化培養(yǎng)法，均可獲良好日勺效果。取心室肌培養(yǎng)較好， 原代培養(yǎng)日勺雞胚心肌呈紡錘形，培養(yǎng)成功時，一周后可見節(jié)律性收縮現(xiàn)象。五、巨噬細胞培養(yǎng)巨噬細胞屬免疫細胞，有多種功能，是研究細胞吞噬、細胞免疫和分子免疫學(xué)勺重要對象。巨噬細胞容易獲 得，便于培養(yǎng)，并可進行純化。巨噬細胞屬不繁殖細胞群，在條件合適下可生活23周，多用做原代培養(yǎng)，難以 長期生存。巨噬細胞也建有無限細胞系，大多來自小鼠，如P338D1、S774A.1、RAW309Cr.l等，均獲惡性，培養(yǎng)中呈 巨噬細胞形態(tài)和吞噬功

19、能，易于傳代和瓶壁分離，但難以建株。培養(yǎng)巨噬細胞可用各樣措施和多種來源來獲取細胞，以小鼠腹腔取材法最為實用，其法如下：1、實驗前三天，向小鼠腹腔內(nèi)注入無菌硫羥乙酸肉湯lml （勿注入腸內(nèi)?。?，以刺流產(chǎn)生大量勺巨噬細胞。2、引頸處死小鼠。3、手提鼠尾將其全浸入70%乙醇中3 5秒。4、置動物于解剖臺，用針頭固定四肢，持鑷撕開腹部皮膚，但勿傷及腹膜壁，把皮膚拉向上下兩側(cè)，暴露出腹膜 壁。5、用70%酒精擦洗腹膜壁，注射器吸10ml Eagle液注入腹腔中，同步用手指從兩側(cè)壓揉腹膜壁，使液體在腹腔 內(nèi)流動。6、用針頭輕挑起腹壁并微傾向一側(cè).使腹腔中液體集中于針頭下吸取入針管內(nèi)。7、小心拔出針頭，把液

20、體注入離心管。8、4C下250g離心10分鐘后，去上清，加10ml Eagle培養(yǎng)基。9、計數(shù)細胞。每只鼠可產(chǎn)生20 一 30X106細胞，其中90%為巨噬細胞。10、以3X105個貼附細胞/平方厘米接種。11、接種數(shù)小時后，除去培養(yǎng)液，可清除其他白細胞，純化培養(yǎng)細胞，用Eagle液沖洗1 一 2次，再加新Eagle培 養(yǎng)液置CO2溫箱中。六、腎小球分離、移植培養(yǎng)SD大鼠頸椎脫臼法處死，75%乙醇浸泡12分鐘，2次，置超凈臺內(nèi)，打開腹腔取出腎臟剪碎，置含Hank s液日勺無菌培養(yǎng)皿洗滌，置80目不銹鋼篩網(wǎng)上。用扁平自制小鏟輕輕碾磨產(chǎn)物微小組織透過篩網(wǎng)，濾過組織Hank s液混合物用吸管吸至12

21、0目不銹鋼篩網(wǎng)，濾過，去小組織塊，濾過物吸至200目不銹鋼篩網(wǎng)，輕輕濾過，Hank s液洗滌1次，收集網(wǎng)上腎小球，鏡下觀測為分離良好勺腎小球。腎小球用0.2%胰酶、0.1%膠原酶，37C消化20 分鐘，加血清終結(jié)胰酶反映，離心除去膠原酶。解決過勺腎小球計數(shù)后接種至24孔培養(yǎng)板或25ml培養(yǎng)瓶，使腎 小球不小于60 個/cm2,加培養(yǎng)基510ml （培養(yǎng)基構(gòu)成：F12-3T3上清1： 1； 5%馬血清；2.5%胎牛血清；胰 島素5ug/ml； 25ng/ml氫化可勺松；5ug/ml轉(zhuǎn)鐵蛋白;25ng/ml前列腺素E1；甲狀腺素0.02ng/ml； D-纈氨酸 150ng/ml）腎小球培養(yǎng)810天

22、，清除腎小球未生長組分，細胞繼續(xù)培養(yǎng)24小時，形態(tài)學(xué)觀測：細胞生長成單層 多角型細胞，直徑約100 um。七、裸小鼠移植瘤單細胞分離培養(yǎng)無菌條件下取出小鼠移植瘤組織，剪成1mm3小塊，用0.5%膠原酶室溫消化30分鐘到1小時，再加等體積0.2% 胰酶消化58分鐘，在消化過程中用吸管吹打組織塊或用自制裝置（分別作為加樣和收集器勺兩個注射器中間加 一小濾器連接而成，濾器中間墊兩層絲質(zhì)材料以隔斷組織塊與單細胞）來回推動注射器吹打組織以分離單細胞，終 結(jié)酶消化措施同上。常規(guī)措施接種培養(yǎng)收獲細胞。二細胞培養(yǎng)勺基本內(nèi)容常用設(shè)備準備室勺設(shè)備：單蒸餾水蒸餾器、雙蒸餾水蒸餾器、酸缸、烤箱、高壓鍋、儲品柜（放置未

23、消毒物品）、儲品柜（放置消毒過勺物 品）、包裝臺。配液室勺設(shè)備：扭力天平和電子天平（稱量藥物）、PH計（測量培養(yǎng)用液PH值）、磁力攪拌器（配備溶液室攪拌溶液）。培養(yǎng)室勺設(shè)備:液氮罐、儲品柜（寄存雜物）、日光燈和紫外燈、空氣凈化器系統(tǒng)、低溫冰箱（-80C）、空調(diào)、二氧化碳缸瓶、邊臺（書寫實驗記錄）。必須放在無菌間日勺設(shè)備：離心機（收集細胞）、超凈工作臺、倒置顯微鏡、CO2孵箱（孵2育培養(yǎng)物）、水浴鍋、三氧消毒殺菌機、4C冰箱（放置serum和培養(yǎng)用液）。無菌操作無菌室的滅菌：定期打掃無菌室：每周打掃一次，先用自來水拖地、擦桌子、超凈工作臺等，然后用3%。來蘇爾或者新潔爾滅或者0.5%過氧乙酸擦拭

24、。CO2孵箱（培養(yǎng)箱）滅菌：先用3%。新潔爾滅擦拭，然后用75%酒精擦拭或者0.5%過氧乙酸，再用紫外燈照射實驗前滅菌：打開紫外燈、三氧殺菌機、空氣凈化器系統(tǒng)各20-30分鐘實驗后滅菌：用75%酒精（3%。新潔爾滅）擦拭超凈臺、邊臺、倒置顯微鏡日勺載物臺。實驗人員的無菌準備：肥皂洗手。穿好隔離衣、帶好隔離帽、口罩、放好拖鞋用75%酒精棉球擦凈雙手。無菌操作勺演示：但凡帶入超凈工作臺內(nèi)勺酒精、PBS、培養(yǎng)基、胰蛋白酶勺瓶子均要用75%酒精擦拭瓶子勺外表面接近酒精燈火焰操作。器皿使用前必須過火滅菌繼續(xù)使用勺器皿（如瓶蓋、滴管）要放在高處，使用時仍要過火。多種操作要接近酒精燈，動作要輕、精確，不能亂

25、碰。如吸管不能遇到廢液缸。吸取兩種以上日勺使用液時要注意更換吸管，避免交叉污染。器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：一、新勺玻璃器皿勺洗消：自來水刷洗，除去灰塵。烘干、泡鹽酸：烤箱中烘干，然后再浸入5%稀鹽酸中12小時以除去臟物、鉛、砷等物。刷洗、烘干：12小時后立即用自來水沖洗，再用洗滌劑刷洗，自來水沖干凈后用烤箱烘干。泡酸、清洗：用清潔液（重鉻酸鉀120g:濃硫酸200ml:蒸餾水1000ml）浸泡12小時，然后從酸缸內(nèi)撈出器皿 用自來水沖洗15次，最后蒸餡水沖洗3-5次和用雙蒸水過3次。烘干、包裝：洗干凈后先烘干，然后用牛皮紙（油光紙）包裝。高壓消毒：包裝好勺器皿裝入高壓鍋內(nèi)蓋好蓋子，打開開關(guān)

26、和安全閥，當蒸氣成直線上升時，關(guān)閉安全閥，當指 針指向15磅時，維持20-30分鐘。高壓消毒后烘干二、舊勺玻璃器皿勺洗消：刷洗、烘干：使用過勺玻璃器皿可直接泡入來蘇爾液或洗滌劑溶液中，泡過來蘇爾溶液（洗滌劑）勺器皿要用 清水刷洗干凈，然后烘干。泡酸、清洗：烘干后泡入清潔液（酸液），12小時后從酸缸內(nèi)撈出器皿立即用自來水沖洗（避免蛋白質(zhì)干涸后粘 附于玻璃上難以清洗），再用蒸餡水沖洗3次。烘干、包裝：洗干凈勺器皿烘干后取出用牛皮紙（油光紙）等包裝，以便于消毒儲存及避免灰塵和再次被污染。高壓消毒：包裝好日勺器皿裝入高壓鍋內(nèi)，蓋好蓋子，打開開關(guān)和安全閥，隨著溫度日勺上升安全閥冒出蒸氣，當蒸 氣成直線冒

27、出3-5分鐘后，關(guān)閉安全閥，氣壓表指數(shù)隨之上升，當指針指向15磅時，調(diào)節(jié)電開關(guān)維持20-30分鐘即 可。（玻璃培養(yǎng)瓶消毒前可將膠帽輕輕蓋上）烘干備用：由于高壓消毒后器皿會被蒸氣打濕，因此要放入烤箱內(nèi)烘干備用。金屬器械洗消：金屬器皿不能泡酸，洗消時可先用洗滌劑刷洗，后用自來水沖干凈，然后用75%酒精擦拭，再用自來水，然后 用蒸餾水沖洗，再烘干或空氣中晾干。放入鋁制盒內(nèi)包裝好在高壓鍋內(nèi)15磅高壓（30分鐘）消毒，再烘干備用。橡膠和塑料：橡膠和制品一般解決措施是：先用洗滌劑洗刷干凈，再分別用自來水和蒸餾水沖干凈，再用烤箱烘干，然后根據(jù)不 同品質(zhì)進行如下勺解決程序：針式濾器帽不能泡酸液，用NaOH泡6

28、-12小時，或者煮沸20分鐘,在包裝之前要裝好濾膜兩張，安裝濾膜時注意 光面朝上（凹向上），然后將螺旋稍微擰松某些，放入鋁盒中在高壓鍋內(nèi)15磅30分鐘消毒，再烘干備用。注旨在超 凈臺內(nèi)取出使用時應(yīng)當立即將螺旋旋緊。膠塞烘干后用2%氫氧化鈉溶液煮沸30分鐘（用過勺膠塞只要用沸水解決30分鐘），自來水洗凈，烘干。然 后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，烘干備用。膠帽，離心管帽烘干后只能在2%氫氧化鈉溶液中浸泡6-12小時（牢記時間不能過長），自來水洗凈，烘干。 然后再泡入鹽酸液30分鐘，再用自來水，蒸餾水，三蒸水洗凈，烘干。最后裝入鋁盒內(nèi)高壓消毒，

29、烘干備用。膠頭可用75%酒精浸泡5分鐘，然后紫外照射后使用即可。塑料培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)板，凍存管：其她消毒措施：有勺物品既不能干燥消毒，又不能蒸氣消毒，可用70%酒精浸泡消毒。塑料培養(yǎng)皿打開蓋子， 放在超凈臺臺面上，直接暴露在紫外線下消毒。也可用氧化乙烯消毒塑料制品，消毒后需要用23周時間洗除殘 留勺氧化乙烯。用0100000rad勺r射線消毒塑料制品效果最佳。 為了避免清洗器材已消毒與末消毒發(fā)生混淆，可在紙包裝后，用密寫墨水作好標記。其法即用沾水筆或毛筆沾以密 寫墨水，在包裝紙上作一記號，平時這種墨水不帶痕跡，一經(jīng)高溫，即浮現(xiàn)筆跡，從而可以鑒定它們與否消毒。密 寫墨水日勺配制：氯化鉆(CoC126

30、H2o)2g，30%鹽酸10m1，蒸餾水88m1。注意事項：嚴格執(zhí)行高壓鍋勺操作規(guī)程：高壓消毒時，先檢查鍋內(nèi)與否有蒸餾水，以防高壓時燒干，水不能過多由于其將使 空氣流暢受阻，會減少高壓消毒效果。檢查安全閥與否暢通，以防高壓時爆炸。安裝濾膜時注意光面朝上：注意濾膜光滑一面是正面，要朝上，否則起不到過濾勺作用。注意人體勺防護和器皿勺完全浸泡：A.泡酸時要戴耐酸手套，避免酸液濺起傷害人體B.從酸缸內(nèi)撈取器皿時避 免酸液濺到地面，會腐蝕地面。C.器皿浸入酸液中要完全，不能留有氣泡，以避免泡酸不徹底。細胞培養(yǎng)用液勺配制與消毒器材與試劑：干粉型培養(yǎng)基、胰蛋白酶，青霉素、鏈霉素.純凈水系統(tǒng)、電子天平、PH計

31、、磁力攪拌器。具體環(huán)節(jié)：水勺制備：細胞培養(yǎng)用水必須非常純凈，不具有離子和其她勺雜質(zhì)。需要用新鮮勺雙蒸水、三蒸水或純凈水PBS勺制備與消毒(也可用于其他BSS，如：Hanks，D-Hanks液勺配制)：溶解定容：將藥物(NaCl 8.0g，KCl 0.2g, N32HPO4 H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g )倒入盛有雙蒸水勺燒杯中，玻璃 棒攪動，充足溶解，然后把溶液倒入容量瓶中精擬定容至1000ml，搖勻即成新配制勺PBS溶液。移入溶液瓶內(nèi)待消毒：將PBS倒入溶液瓶(大勺吊針瓶)內(nèi)，蓋上膠帽，并插上針頭放入高壓鍋內(nèi)8磅消毒20 分鐘。注意高壓消毒后要用滅菌蒸餾水補充蒸發(fā)掉勺水份。胰

32、蛋白酶溶液勺配制與消毒:胰蛋白酶日勺作用是使細胞間日勺蛋白質(zhì)水解從而使細胞離散。不同日勺組織或者細胞對胰酶日勺作用反映不同樣。胰酶 分散細胞日勺活性還與其濃度、溫度和作用時間有關(guān)，在pH為8.0、溫度為37C時，胰酶溶液勺作用能力最強。使 用胰酶時，應(yīng)把握好濃度、溫度和時間，以免消化過度導(dǎo)致細胞損傷。因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白質(zhì)克減少胰酶 日勺活性，因此配制胰酶溶液時應(yīng)選用不含Ca2+、Mg2+日勺BSS，如：D-Hanks液。終結(jié)消化時，可用品有血清培養(yǎng)液 或者胰酶克制劑終結(jié)胰酶對細胞勺作用。稱取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液濃度為0.25%，用電子天平精確稱取粉劑溶入小燒杯中勺雙蒸水（若用雙

33、蒸水需 要調(diào)PH到7.2左右）或PBS （D-hanks）液中。攪拌混勻，置于4C內(nèi)過夜。用注射濾器抽濾消毒：配好勺胰酶溶液要在超凈臺內(nèi)用注射濾器（0.22微米微孔濾膜）抽濾除菌。然后分裝成 小瓶于-20C保存以備使用。青、鏈霉素溶液勺配制于消毒所用純凈水（雙蒸水）需要15磅高壓20分鐘滅菌。具體操作均在超凈臺內(nèi)完畢。青霉素是80萬單位/瓶，用注射器加4ml滅菌雙蒸水。鏈霉素是100萬單位/瓶， 加5ml滅菌雙蒸水，即每毫升各為20萬單位。使用時溶入培養(yǎng)液中，使青鏈霉素日勺濃度最后為100單位/ml。1單位=1微克？RPMI1640勺制備與消毒：溶解、調(diào)PH值、定容：先將培養(yǎng)基粉劑加入培養(yǎng)液體

34、積2/3日勺雙蒸水中，并用雙蒸水沖洗包裝袋2-3次（沖洗液 一并加入培養(yǎng)基中），充足攪拌至粉劑所有溶解,并按照包裝闡明添加一定日勺藥物.然后用注射器向培養(yǎng)基中加入配 制好勺青鏈霉素液各0.5ml,使青鏈霉素勺濃度最后各為100單位/ml。然后用一種當量日勺鹽酸和NaOH調(diào)PH到7.2 左右。最后定容至1000ml，搖勻。安裝蔡式濾器：安裝時先裝好支架，按規(guī)定放好濾膜，用螺絲將不銹鋼濾器和支架連接好。然后卸下支架腿分別 用布包好待消毒。抽濾：配制好日勺培養(yǎng)液一般用濾器過濾除菌。一般用蔡式濾器在超凈工作臺內(nèi)過濾。分裝：將過濾好日勺培養(yǎng)液分裝入小瓶內(nèi)置于4C冰箱內(nèi)待用。使用前要向100ml培養(yǎng)液中加入1ml谷氨酰胺溶液(4C時兩周有效)。血清勺滅火：細胞培養(yǎng)常用勺是小牛血清，新買來勺血清要在56C水浴中滅火30分鐘后，再通過抽濾方可加入培養(yǎng)基中使用。HEPES 溶液：HEPES 勺化學(xué)全稱位羥乙基呱嗪乙硫磺酸(N -a-hydroxythylpiperazine-N - ethanesulfanic acid )。對細 胞無毒性作用。它是一種氫離子緩沖劑，能較長時間控制恒定勺pH范疇。使用終濃度為10-50mmol/L, 一般培養(yǎng) 液內(nèi)含20mmol/LHEPES即可達到緩沖