基因表達(dá)分析技術(shù)課件

1、 基因表達(dá)分析技術(shù)METHODS FOR ANALYZING GENE EXPRESSION基因表達(dá)分析技術(shù)基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈基因表達(dá)基因mRNA蛋白質(zhì)多肽鏈基因表達(dá)一、通過(guò)檢測(cè)mRNA揭示基因轉(zhuǎn)錄水平的表達(dá)特征根據(jù)分析方法的原理和功能特性，可將基因表達(dá)分析分為:封閉性系統(tǒng)研究方法: 例如DNA微陣列、Northern印跡、實(shí)時(shí)RT-PCR等方法。只能研究已知的基因。開放性系統(tǒng)研究方法: 如差異顯示PCR、雙向基因表達(dá)指紋圖譜、分子索引法、隨機(jī)引物PCR指紋分析等，可以發(fā)現(xiàn)和分析未知的基因。這里主要針對(duì)已知基因的常用表達(dá)分析方法做一介紹。一、通過(guò)檢測(cè)mRNA根據(jù)分析方法的原理和功能特性，

2、可將基因表（一）基于雜交原理檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平1Northern 印跡（Northern blot）是一種基于RNA-DNA雜交原理建立的一種RNA分析技術(shù)指將RNA變性及電泳分離后，并轉(zhuǎn)移到固相支持物上，用雜交反應(yīng)來(lái)鑒定其中特定mRNA分子的含量及其大小。（一）基于雜交原理檢測(cè)mRNA的表達(dá)水平1Northern三種印跡技術(shù)的比較三種印跡技術(shù)的比較RNA瓊脂糖凝膠電泳3kb0.4 kbNt36382604623Northern blot hybridization28S18SRNA瓊脂糖凝膠電泳3kbNtNorthern blot h分子雜交實(shí)驗(yàn)分子雜交實(shí)驗(yàn)放射自顯影照片目 錄放射自顯影

3、照片目 錄2核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)（ribonuclease protection assay，RPA）是靈敏度和特異性很高的mRNA定量分析方法 基本原理 是將標(biāo)記的特異RNA探針（32P或生物素）與待測(cè)的RNA樣品液相雜交，標(biāo)記的特異RNA探針與目的RNA結(jié)合，形成雙鏈RNA，免受RNA酶的消化；而未結(jié)合的單鏈RNA經(jīng)RNA酶A或RNA酶T1消化形成寡核糖核酸。2核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)RPA基本程序：待測(cè)RNA的分離體外轉(zhuǎn)錄標(biāo)記RNA探針待測(cè)RNA與探針RNA進(jìn)行液相雜交 RNA酶消化不同大小雜交片段凝膠電泳分離RPA基本程序：待測(cè)RNA的分離核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)原理示意圖32P標(biāo)記的探針：雜交雙鏈

4、進(jìn)行變性PAGE， 用放射自顯影或磷屏成像系統(tǒng)檢測(cè)探針的信號(hào)；生物素標(biāo)記的探針：雜交雙鏈經(jīng)過(guò)變性PAGE后，電轉(zhuǎn)移至尼龍膜，用鏈霉親和素辣根過(guò)氧化物酶和化學(xué)發(fā)光底物與膜上biotin標(biāo)記的探針結(jié)合，X射線膠片或化學(xué)發(fā)光圖像分析儀檢測(cè)雜交信號(hào)。核糖核酸酶保護(hù)實(shí)驗(yàn)原理示意圖32P標(biāo)記的探針：雜交雙鏈進(jìn)行變RPA比Northern Blot的優(yōu)勢(shì)：1.過(guò)量的探針與目的基因的雜交在液相環(huán)境完成，反應(yīng)更加完全 2.RPA比Northern Blot靈敏15150倍，適合檢測(cè)各種表達(dá)水平之基因 3.RPA通量高，同時(shí)檢測(cè)多個(gè)基因，可評(píng)價(jià)他們?cè)谕磺闆r下的差異表達(dá) 4.一次RPA就能完成10 多次North

5、ern Blot的工作，加快研究速度RPA比Northern Blot的優(yōu)勢(shì)：可細(xì)胞或組織中原位表達(dá)的mRNA進(jìn)行區(qū)域定位標(biāo)記探針特異性地與目標(biāo)靶mRNA序列雜交，檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)來(lái)確定基因在組織和細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的區(qū)位信息?？勺鳛槎糠治龅难a(bǔ)充。3原位雜交（in situ hybridization，ISH）可細(xì)胞或組織中原位表達(dá)的mRNA進(jìn)行區(qū)域定位3原位雜交（i原位雜交技術(shù)主要步驟：材料處理及細(xì)胞樣品的固定；樣品的制備和預(yù)處理；探針的制備和預(yù)雜交；探針及樣品的變性；雜交溫育；檢測(cè)雜交信號(hào)，進(jìn)行結(jié)果分析。原位雜交技術(shù)主要步驟：材料處理及細(xì)胞樣品的固定；（二）RT-PCR常用的mRNA檢測(cè)方法1反轉(zhuǎn)錄

6、PCR可用于mRNA的半定量分析 反轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 它以mRNA為模板，體外擴(kuò)增cDNA，再以cDNA為模板進(jìn)行特定基因轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物的PCR擴(kuò)增。RT-PCR技術(shù)一般用于RNA的定性分析；如果設(shè)置陽(yáng)性參照，則可對(duì)待測(cè)RNA樣品進(jìn)行半定量分析。反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)定量PCR （二）RT-PCR常用的mRNA檢測(cè)方法1反轉(zhuǎn)錄PCR逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增逆轉(zhuǎn)錄酶聚合酶mRNAcDNA雜化雙鏈PCR擴(kuò)增PCR技術(shù)原理PCR技術(shù)原理5Primer 15Primer 2Cycle 2Cycle 155 55 5 5Template

7、 DNA55 555 5 55一、基本工作原理目 錄5Primer 15Primer 2Cycle 2CycCycle 355 555 5 555 5 55 555 52530 次循環(huán)后，模板DNA的含量可以擴(kuò)大100萬(wàn)倍以上。目 錄Cycle 355 555 5 555 5模板DNA 特異性引物耐熱DNA聚合酶 dNTPs Mg2+ PCR體系基本組成成分模板DNAPCR體系基本組成成分PCR的基本反應(yīng)步驟變性95C延伸72C退火Tm-5CPCR的基本反應(yīng)步驟變性延伸退火實(shí)驗(yàn)儀器電泳儀實(shí)驗(yàn)儀器電泳儀瓊脂糖凝膠電泳槽瓊脂糖凝膠電泳槽PCR儀PCR儀PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件PCR過(guò)程PCR的特點(diǎn)

8、PCR反應(yīng)PCR反應(yīng)條件實(shí)驗(yàn)結(jié)果PCR結(jié)果。1、對(duì)照(無(wú)模板)；26、PCR產(chǎn)物（5ul樣品）實(shí)驗(yàn)結(jié)果PCR結(jié)果。1、對(duì)照(無(wú)模板)；26、PCR產(chǎn)物（凝膠成像系統(tǒng)凝膠成像系統(tǒng)Target AmplificationNo. ofNo. Amplicon CyclesCopies of Target122438416532664201,048,576301,073,741,8241 cycle = 2 Amplicon2 cycle = 4 Amplicon3 cycle = 8 Amplicon4 cycle = 16 Amplicon5 cycle = 32 Amplicon6 cycle

9、= 64 Amplicon7 cycle = 128 AmpliconTarget AmplificationNo. ofNo.常規(guī)PCR方法的局限性分析：無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量,只能對(duì)終產(chǎn)物進(jìn)行分析必須在擴(kuò)增后用電泳方法分析,費(fèi)時(shí)費(fèi)力而且EB有毒無(wú)法對(duì)擴(kuò)增反應(yīng)實(shí)時(shí)檢測(cè)常規(guī)PCR方法的局限性分析：無(wú)法對(duì)起始模板準(zhǔn)確定量,只能對(duì)終2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time PCR）2、實(shí)時(shí)熒光定量PCR （real-time PC非特異性的嵌入熒光染料 （Non-specific DNA binding dyes）SYBR Green ISYBR GoldEthidium Bromide 非特

10、異性的嵌入熒光染料 （Non-specific DNAExtension53535353Extension ContinuedApply ExcitationWavelength535355TaqTaq353TaqTaq55RepeatDNA binding dyesBDBDBDBDBDBDBDBDBDBDlllllExtension53535353Exten實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理目 錄實(shí)時(shí)PCR技術(shù)原理目 錄非特異性的嵌入熒光染料評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：與特異性的熒光探針相比價(jià)格便宜 只需要設(shè)計(jì)PCR引物缺點(diǎn)：由于它和模板的結(jié)合是非特異性 的，它可以和所有的雙鏈DNA包括引物和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)物結(jié)合，不能真實(shí)反

11、映目 的基因的擴(kuò)增情況。非特異性的嵌入熒光染料評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：與特異性的熒光探針相比價(jià)格便TaqMan探針 評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：熒光信號(hào)強(qiáng) 與其它探針相比設(shè)計(jì)簡(jiǎn)單 可用于多通道檢測(cè) 可用于SNP的檢測(cè)缺點(diǎn)：比DNA結(jié)合染料價(jià)格高TaqMan探針 評(píng)價(jià)優(yōu)點(diǎn)：熒光信號(hào)強(qiáng)Ct value and Real-Time Quantitative PCR TheoryCt值（Threshold Cycle） PCR擴(kuò)增過(guò)程中，擴(kuò)增產(chǎn)物熒光信號(hào)超過(guò)基線值（進(jìn)入指數(shù)增長(zhǎng)期）時(shí)的循環(huán)數(shù)。Ct value and Real-Time Quantit 模板起始濃度越高，Ct值越小 Ct值與模板起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)存在線性關(guān)系Ct值與模

12、板起始濃度的關(guān)系 如果模板濃度增加1倍，Ct值就提前1個(gè)循環(huán)到達(dá) 如果模板濃度減少1倍，Ct值就滯后1個(gè)循環(huán)到達(dá) 模板起始濃度越高，Ct值越小Ct值與模板起始濃度的關(guān)系 如絕對(duì)定量可以得到某個(gè)樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度 利用已知起始拷貝數(shù)的標(biāo)準(zhǔn)品可作出標(biāo)準(zhǔn)曲線，其中橫坐標(biāo)代表起始拷貝數(shù)的對(duì)數(shù)，縱坐標(biāo)代表Ct值。因此，只要獲得未知樣品的Ct值，即可從標(biāo)準(zhǔn)曲線上計(jì)算出該樣品的起始拷貝數(shù)。絕對(duì)定量可以得到某個(gè)樣本中基因的拷貝數(shù)和濃度 利用已知起始拷基因表達(dá)分析技術(shù) 3、原位PCR技術(shù)基因表達(dá)分析技術(shù)原位 原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（In Still PCR,IsPCR）是由Haase等于1990年首創(chuàng)。它是利

13、用完整的細(xì)胞作為一個(gè)微小的反應(yīng)體系來(lái)擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)的目的片段,在不破壞細(xì)胞的前提下,利用一些特定的檢測(cè)手段來(lái)檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)的擴(kuò)增產(chǎn)物。 直接用細(xì)胞涂片或石蠟包埋組織切片在單個(gè)細(xì)胞中進(jìn)行擴(kuò)增。可進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)定位。 適用于檢測(cè)病理切片中含量較少的靶序列原位 原位聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（In Still PC16塊載玻片及24個(gè)0.2ml管的樣品block 16塊載玻片及24個(gè)0.2ml管的樣品block 基因表達(dá)分析技術(shù)操作步驟1. 細(xì)胞或組織固定：細(xì)胞經(jīng)固定和乙醇通透化處理后便適于一般PCR試劑（包括引物和Taq酶）2. PCR擴(kuò)增細(xì)胞內(nèi)目的片段3. 原位雜交檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物A.陽(yáng)性對(duì)照B.陰性對(duì)照C.原位檢測(cè)mRN

14、A表達(dá)操作步驟A.陽(yáng)性對(duì)照B.陰性對(duì)照C.原位檢測(cè)mRNA表達(dá)DNA芯片(DNA chip) cDNA芯片(cDNA chip)是指將許多特定的DNA片段或cDNA片段作為探針，有規(guī)律地緊密排列固定于單位面積的支持物上 。4、基因芯片分析基因表達(dá)譜（高通量地分析基因表達(dá)）基因芯片(gene chip)DNA芯片(DNA chip) 4、基因芯片分析基因表達(dá)譜基目 錄目 錄二、通過(guò)蛋白質(zhì)檢測(cè)揭示基因 翻譯水平的表達(dá)特征 Western印跡（Western blot）是一種免疫印跡技術(shù)，其基本原理與核酸分子雜交相似，只是以偶聯(lián)標(biāo)記物的抗體分子作為探針，檢測(cè)轉(zhuǎn)移到固相支持物上的蛋白質(zhì)/多肽分子。當(dāng)在

15、蛋白質(zhì)水平上檢測(cè)特定基因的表達(dá)活性時(shí)，最常用的方法就是利用Western印跡對(duì)細(xì)胞或組織的總蛋白質(zhì)中的特異蛋白質(zhì)進(jìn)行定性和半定量分析。（一）采用特異抗體經(jīng)Western印跡可直接 測(cè)定基因編碼多肽二、通過(guò)蛋白質(zhì)檢測(cè)揭示基因 Western印跡蛋白質(zhì)樣品的制備SDS分離蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)膜特異抗體（即第一抗體）與膜上的蛋白質(zhì)（抗原）印跡雜交再經(jīng)偶聯(lián)了可檢測(cè)標(biāo)記信號(hào)的第二抗體（即抗抗體，商品試劑盒中多采用偶聯(lián)辣根過(guò)氧化物酶的Ig）最后經(jīng)與酶的底物反應(yīng)而顯影、成像，經(jīng)掃描后獲取免疫印跡信息Western blot基本程序Western blot基本程序基因表達(dá)分析技術(shù)基因表達(dá)分析技術(shù)基因表達(dá)分析技術(shù)West

16、Blot West Blot 受檢標(biāo)本+固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)結(jié)合特異抗體（一抗）酶連接的第二抗體（也可預(yù)先包被抗體，“吸附”抗原），再進(jìn)行酶-底物反應(yīng)。反應(yīng)后通過(guò)專門的酶標(biāo)儀測(cè)定、記錄數(shù)據(jù)。（二）酶聯(lián)免疫吸附分析（Enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）受檢標(biāo)本+固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)結(jié)合特異抗體（一特點(diǎn)：1、具有特異性；2、靈敏度很高；3、穩(wěn)定、操作簡(jiǎn)便，標(biāo)本用量少，適于大規(guī)模篩查， 尤 其適用于檢測(cè)體液中微量的特異性抗體或抗原；4、既可以做定性試驗(yàn)也可以做定量分析。 酶聯(lián)免疫吸附分析特點(diǎn)： 酶聯(lián)免疫吸附分析 免疫組織化學(xué)（immun

17、ohistochemistry）是利用標(biāo)記的特異性抗體通過(guò)抗原-抗體反應(yīng)和顯色反應(yīng)，在組織或細(xì)胞原位檢測(cè)特定抗原（即目標(biāo)蛋白質(zhì)）的方法，簡(jiǎn)稱為免疫組化實(shí)驗(yàn)。近年來(lái)由于熒光標(biāo)記抗體的廣泛應(yīng)用，這兩種方法又被統(tǒng)稱為免疫熒光法。（三）免疫組化實(shí)驗(yàn)對(duì)組織/細(xì)胞 表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行原位檢測(cè) 免疫組織化學(xué)（immunohistochem基因表達(dá)分析技術(shù)人皮膚角化細(xì)胞免疫熒光染色人皮膚角化細(xì)胞免疫熒光染色（immunofluorescence），可應(yīng)用熒光（倒置）顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡（confocal microscopy）對(duì)靶分子進(jìn)行定性、定量和定位分析，激光共聚焦顯微鏡還可進(jìn)行斷層成像，是在蛋白質(zhì)水平

18、分析基因表達(dá)的直觀方法。其中抗體對(duì)于蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的特異性、種間交叉反應(yīng)、檢測(cè)系統(tǒng)的靈敏性以及細(xì)胞或組織的固定類型是該方法的關(guān)鍵因素。運(yùn)用雙重著色或多重著色程序同時(shí)對(duì)多個(gè)感興趣的靶分子進(jìn)行檢測(cè)，是一種揭示更多有關(guān)細(xì)胞群的功能和它們之間相互作用信息的有效方法。免疫組化主要是作為定性、定位的技術(shù)，若結(jié)合密度計(jì)量系統(tǒng)、圖像分析系統(tǒng)等測(cè)量工具也可以得到定量的數(shù)據(jù)。（immunofluorescence），可應(yīng)用熒光（倒置） 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry）在細(xì)胞水平分析特定蛋白質(zhì)的基本原理也是抗原-抗體反應(yīng)，它利用熒光標(biāo)記抗體與抗原的特異性結(jié)合，經(jīng)過(guò)流式細(xì)胞儀分析熒光信號(hào)，從而根據(jù)細(xì)胞表達(dá)特定蛋

19、白質(zhì)的水平對(duì)某種蛋白質(zhì)陽(yáng)性細(xì)胞（即特異基因表達(dá)的細(xì)胞）作出判斷。（四）流式細(xì)胞術(shù)用于分析細(xì)胞 特異表達(dá)的蛋白質(zhì) 流式細(xì)胞術(shù)（flow cytometry）流式細(xì)胞術(shù)可以檢測(cè)活細(xì)胞，也可以檢測(cè)用甲醛固定的細(xì)胞。廣泛應(yīng)用于細(xì)胞表面和細(xì)胞內(nèi)分子表達(dá)水平的定量分析，并能夠根據(jù)各種蛋白質(zhì)的表達(dá)模式區(qū)分細(xì)胞亞群。此外，流式細(xì)胞術(shù)可以使用多個(gè)熒光標(biāo)記的抗體同時(shí)對(duì)多個(gè)基因產(chǎn)物進(jìn)行標(biāo)記和監(jiān)測(cè)，是對(duì)細(xì)胞進(jìn)行快速分析、分選、特征鑒定的一種有效方法。流式細(xì)胞術(shù)可以檢測(cè)活細(xì)胞，也可以檢測(cè)用甲醛固定的細(xì)胞。是將具有高度親和特異性的探針?lè)肿樱ㄈ鐔慰寺】贵w）固定在基片上，用以識(shí)別復(fù)雜生物樣品溶液中的目標(biāo)多肽；蛋白質(zhì)功能芯片可

20、用來(lái)研究蛋白質(zhì)修飾、蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)/DNA-蛋白質(zhì)/RNA-蛋白質(zhì)，以及蛋白質(zhì)與脂質(zhì)、蛋白質(zhì)與藥物、酶與底物、小分子-蛋白質(zhì)等的相互作用（五）蛋白質(zhì)芯片分析蛋白質(zhì)表達(dá)譜（高通量地分析基因表達(dá)）蛋白質(zhì)芯片(protein chip)是將具有高度親和特異性的探針?lè)肿樱ㄈ鐔慰寺】贵w）固定在基片上蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片包括:抗體芯片抗原芯片配體芯片等蛋白質(zhì)檢測(cè)芯片包括: 目前比較和鑒定蛋白質(zhì)表達(dá)譜更多采用雙向電泳（two-dimensional electrophoresis, 簡(jiǎn)稱2-D電泳）結(jié)合質(zhì)譜技術(shù)。 原理: 根據(jù)蛋白質(zhì)分子的兩個(gè)屬性等電點(diǎn)和分子質(zhì)量將蛋白質(zhì)混合物進(jìn)行分離。電泳結(jié)果經(jīng)染色后，即可對(duì)不同

21、樣品中蛋白質(zhì)的表達(dá)譜進(jìn)行比較；還可從凝膠中將特定的蛋白質(zhì)點(diǎn)切下，經(jīng)胰蛋白酶消化后得到短肽片段，利用質(zhì)譜（mass spectrum）技術(shù)進(jìn)行定性分析，對(duì)差異表達(dá)的蛋白質(zhì)進(jìn)行鑒定。 可同時(shí)分離數(shù)成百上千的蛋白質(zhì)。（六）雙向電泳結(jié)合質(zhì)譜普遍用于蛋白質(zhì)表達(dá)譜的分析和鑒定 目前比較和鑒定蛋白質(zhì)表達(dá)譜更多采用雙向電泳（tw 雙 向 電 泳 技 術(shù)Two-dimemsional gel electrophoresis, 2DE技術(shù)構(gòu)成：第一相：IEF 采用丙烯酰胺與不同PH的兩性 電介質(zhì)形成的固定的PH梯度 IEF- PAGE第二相：分子篩凝膠 SDS- PAGE特點(diǎn)：1. 一次分離細(xì)胞中幾乎所有的蛋白質(zhì)

22、（以spot形式出現(xiàn)）2. 高靈敏度和高分辨率 用銀染條件下，可達(dá)10-1510-18 mol水平3. 便于計(jì)算機(jī)分析處理 電泳分離圖譜經(jīng)掃描輸入計(jì)算機(jī)，可以進(jìn)行蛋白質(zhì)定位, 等電點(diǎn),分子量定量不同條件下的圖譜進(jìn)行比較,建立蛋白質(zhì)組數(shù)據(jù)庫(kù) 雙 向 電 基因表達(dá)分析技術(shù)基因表達(dá)分析技術(shù)基因表達(dá)分析技術(shù)基因表達(dá)分析技術(shù)質(zhì) 譜 技 術(shù) 質(zhì)譜儀 進(jìn)樣系統(tǒng) 離子源 質(zhì)量分析器 離子探測(cè)器系統(tǒng)質(zhì) 譜 技 術(shù) 質(zhì)譜儀在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中常用的質(zhì)譜儀電噴霧離子化質(zhì)譜儀（ESI-MS）基質(zhì)輔助的激光解吸離子化飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF-MS）四極桿-TOF質(zhì)譜儀（Q-TOF）在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中常用的質(zhì)譜儀

23、電噴霧離子化質(zhì)譜儀（ESI-M質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組研究中的作用1. 肽質(zhì)譜和肽的序列分析2. 翻譯后修篩的蛋白質(zhì)鑒定 N端封閉，磷酸化，糖基化3. 其它：蛋白質(zhì)二硫鍵的定量和定位蛋白質(zhì)蛋白質(zhì)相互作用的分析蛋白質(zhì)其它分子相互作用的分析蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)的分析比較不同條件（正常細(xì)胞與異常細(xì)胞，不同發(fā)育階段從中獲得單個(gè)有價(jià)值的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能質(zhì)譜技術(shù)在蛋白質(zhì)組研究中的作用1. 肽質(zhì)譜和肽的序列分析標(biāo)簽融合蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)流程示意圖標(biāo)簽融合蛋白沉淀實(shí)驗(yàn)流程示意圖 白質(zhì)相互作用研究領(lǐng)域里得到極大的推廣。GST融合蛋白在經(jīng)過(guò)固定有GST(glutathione)的色譜柱時(shí)，就可以通過(guò)GST 與GSH的相互作用而被吸附。當(dāng)再有細(xì)胞抽提物過(guò)柱，就可得到能夠與“誘餌”蛋白相互作用的興趣蛋白。一般來(lái)說(shuō)GST融合蛋白pull-down方法用于兩個(gè)方面： 一是鑒定與已知融合蛋白相互作用的未知蛋白質(zhì) 二是鑒定兩個(gè)已知蛋白質(zhì)之間是否存