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文檔簡介

1、第二章 實驗室儀器設備、器皿及用具白鳳麟2013.9.12一、實驗室設置二、實驗室儀器三、實驗室器皿及用具四、洗滌技術五、滅菌技術六、無菌操作技術 組織培養(yǎng)實驗室布局的總體要求 便于隔離 便于操作 便于滅菌 便于觀察一、實驗室設置基本布局規(guī)律根據(jù)實驗操作程序排列實驗室;接種室和培養(yǎng)室設在與外界環(huán)境隔離性好的區(qū)域;滅菌室與接種室相鄰;其他實驗室的布局可根據(jù)條件,以方便使用為宜?;緦嶒炇也季制矫鎴D實驗臺擱架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架培養(yǎng)架藥品及儀器柜無菌臺無菌臺擱架拉窗冰箱擱 架水槽電爐門4.5m3.0m3.5m4.0m準備室緩沖室無菌室培養(yǎng)室植物組織培養(yǎng)實驗室布局示意圖培 養(yǎng) 室準 備 室滅菌室儲藏室

2、接種室緩沖室組織培養(yǎng)準備實驗室1.準備室1.1 洗滌間 根據(jù)工作量的大小決定其大小,一般面積控制在30-50m2。在實驗室的一側設置專用的洗滌水槽,用來清洗玻璃器皿。中央實驗臺還應配置2個水槽,用于清洗小型玻璃器皿。如果工作量大,可以購置一臺洗瓶機。準備1-2個洗液缸,專門用于洗滌對潔凈度要求很高的玻璃器皿。此外還應配置落水架、干燥箱、柜子、超聲波清洗器等。地面應耐濕并排水良好。 面積60平方米左右,配備的主要儀器設備有 :冰箱、天平、微波爐、pH計、培養(yǎng)基分裝器、藥品柜、器械柜、抽氣泵、電爐、各種規(guī)格的培養(yǎng)瓶、培養(yǎng)皿、移液管、燒杯、量筒、容量瓶、儲藏瓶等。冰箱以體積180-200L為宜,用于

3、儲存培養(yǎng)基母液、激素維生素等貴重藥品、彩色膠卷、及保存植物材料。天平應有不同感量。1.2培養(yǎng)基配制間1.準備室 配備實驗臺、高壓滅菌鍋、排風滅火設備、細菌過濾設備、干熱消毒柜、電爐等。滅菌鍋的選擇應根據(jù)不同的要求選擇不同型號的滅菌鍋。一般實驗室可選用小型的醫(yī)用手提式高壓滅菌鍋,較大的實驗室可選用立式自動控制壓力和溫度的滅菌鍋。 生產(chǎn)性的實驗室可選用大型的臥式滅菌鍋。 如果沒有條件的話,可以將上述工作間合并成一個準備間,要求是設備的安裝和排列要合理、房間要寬敞、明亮、透風,地面要便于清潔、防滑。1.3 消毒間1.準備室 無菌操作室主要用于實驗材料的接種操作,所以又叫接種室。通常由里外兩間組成,外

4、間是緩沖間,用于準備工作,還有防止污染的作用。緩沖間的門應該與接種室的門錯開,兩個門也不要同時開啟,以保證無菌室不因開門和人的進出帶進雜菌。緩沖間內應該設有水槽、實驗臺、鞋帽架、和柜子、紫外燈。無菌操作室的內壁應當用塑鋼板或瓷磚裝修,工作人員進入操作間前要穿上消過毒的工作服和拖鞋。 室內應配有超凈工作臺,紫外燈、解剖鏡、各種接種器械等。 3. 無菌操作室無菌室無菌室 為了控制培養(yǎng)室的溫度和光照時間及其強度,培養(yǎng)室的房間不要窗戶,但應當留一個通氣窗,并安上排氣扇。室內溫度由空調控制,光照由日光燈控制。天花板和內墻最好用塑料鋼板裝修,地面用水磨石或瓷磚鋪設,一般要分兩間,一為光照培養(yǎng)室,一為暗培養(yǎng)

5、。培養(yǎng)室外應有一預備間或走廊。 培養(yǎng)室應配有培養(yǎng)架、轉床、搖床、光照培養(yǎng)箱、生化培養(yǎng)箱、自動控時器等。日光燈一般用40W,固定在培養(yǎng)架的側面或擱板的下面,每層有兩支日光燈,距離在20cm,光照強度為2000-3000lx。4. 培養(yǎng)室設計組培實驗室時的注意事項為了減少污染,實驗室最好設一走廊且走廊上方最好安裝紫外燈;培養(yǎng)室最好設在南面,設大玻璃窗,以雙層玻璃窗為最好。如果培養(yǎng)室是設在房屋的邊側,其東邊或西邊的墻上也可設置大玻璃窗;培養(yǎng)室房間及門要小,而且密閉性要好,最好裝移門;無菌操作室要小,要設緩沖間,也最好裝移門,且門要稍大一些。酸度計電熱套天平2、滅菌設備 蒸汽壓力滅菌鍋、干熱消毒柜、過

6、濾滅菌裝置、噴霧消毒器、紫外燈。蒸汽壓力滅菌鍋無菌瓶頂過濾裝置噴霧消毒器(參考圖)(參考圖)接種器具消毒器3、無菌操作設備 超凈工作臺4、細胞培養(yǎng)設備 搖 床培養(yǎng)架恒溫振蕩培養(yǎng)箱光照培養(yǎng)箱 5、細胞學鑒定設備 光學研究顯微鏡、實體顯微鏡、倒置顯微鏡倒置顯微鏡光學顯微鏡1、玻璃器皿三、培養(yǎng)器皿及實驗用具培養(yǎng)皿三角瓶培養(yǎng)瓶2、金屬材質用具鑷子解剖刀接種針1、玻璃器皿洗滌新購置玻璃器皿1%稀HCl浸漬12h洗衣粉洗滌清水沖洗晾干備用已用過的玻璃器皿四、洗滌技術清洗后器皿內外不可掛有水珠,否則重洗,若重洗后仍掛有水珠,則需用洗液浸泡數(shù)小時后(或用去污粉擦洗),重新清洗。2、塑料用品洗滌新的塑料器皿打開

7、即用已用過的塑料器皿2%NaOH浸泡12h清水沖洗2%5%鹽酸浸泡30min清水沖洗蒸餾水沖洗晾干備用 金屬用品一般不宜用各種洗滌液洗滌(新的可以用熱洗衣粉水洗凈),需要清洗時,一般用酒精擦洗,然后火焰干燥。 3、金屬用品洗滌(一)、滅菌工作是極其重要的。 首先應建立有菌和無菌的概念有菌的范疇:有菌:凡是暴露在空氣中的物體,至少其表面都是有菌的。如植物的表面、超凈工作臺的臺面,未處理的工具和手等。 無菌:高壓高溫處理(工具、器皿、培養(yǎng)基等) 物理或化學處理; 火烤后的物體; 健康的動植物不與內外部表面接觸的組織 內部可能是無菌的(有時也有內生菌,但 不會影響培養(yǎng),也不會污染)五. 滅菌技術1、

8、物理方法:干熱、濕熱、過濾(0.25微米)紫外燈、超聲波等。 2、化學方法:使用滅菌劑或抗菌素,如酒精、次氯酸鈉、升汞、漂白粉、高錳酸鉀、雙氧水、福爾馬林等。 五. 滅菌技術干熱滅菌 玻璃器皿、器械 濕熱滅菌 培養(yǎng)基、蒸餾水、器械、棉塞等熏蒸滅菌 接種室、培養(yǎng)室過濾滅菌 液體培養(yǎng)基、蒸餾水藥劑滅菌 培養(yǎng)材料燒灼滅菌 器械、瓶口、棉塞、包頭紙輻射滅菌 接種室、培養(yǎng)間(一)各種滅菌方法及其使用范圍 適用于玻璃器皿和金屬器械的滅菌。操作方法:150 、40min或120 、120min,如果發(fā)現(xiàn)芽孢桿菌,160 、90120min(1)干熱滅菌 適用于各種器皿、培養(yǎng)基、器皿、蒸餾水、棉塞、紙等。12

9、1 維持2030min注意點:加足水、排盡氣、氣壓降到0時,才能開蓋。(2)濕熱滅菌 培養(yǎng)基的滅菌一般用高壓高溫處理,但如果培養(yǎng)基中某些成分遇到高溫分解(如某些生長調節(jié)劑GA3、玉米素等),就需要過濾滅菌。另外酶、血清等也需要過濾滅菌。 滅菌方法:將生長調節(jié)劑或酶配成一定濃度,用注射器注入微孔濾膜慮,濾膜孔徑0.220.45微米。制培養(yǎng)基時,現(xiàn)將培養(yǎng)基高壓滅菌,待降至50左右時,加入適量的激素,然后分裝。(3)過濾滅菌 主要是利用紫外燈進行照射,適合實驗室空氣、操作臺等,滅菌時間2030min。注意:關燈后5min后再進入。超凈工作臺關燈后要打開風機。(4)射線滅菌 用火焰灼燒達到滅菌目的,適

10、用于接種器皿的滅菌。(5)火焰灼燒滅菌適用外植體、實驗器皿、操作表面、皮膚等。幾種常用消毒劑的效果比較消 毒 劑使用濃度(%)消毒時間(min.)效 果殘液去除難易乙醇70-750.1-3好易新潔爾滅1020530好易氯化汞0.11215最好最難過氧化氫1012515較好最易抗菌素450mgl-13060較好較難次氯酸鈣/納9 10530好易(6)消毒劑 長期不用的培養(yǎng)室或接種室要進行熏蒸。方法:甲醛、高錳酸鉀熏蒸。 甲醛的用量通常按每立方米空間2-6毫升計算,高錳酸鉀的用量是甲醛的一半。室內準備妥當后,把稱好的高錳酸鉀放在瓷碗或燒杯內(最好在碗或杯下面鋪一張報紙,以利清洗),然后將甲醛也倒入

11、碗或杯內,立即出屋關門。幾秒鐘后,甲醛溶液即沸騰揮發(fā)。高錳酸鉀是一種氧化劑,當它與一部分甲醛作用時,由氧化反應產(chǎn)生的熱可使其余的甲醛揮發(fā)為氣體。(7)熏蒸滅菌 甲醛熏蒸接種室應至少在使用前24小時進行,熏蒸后密閉保持4小時以上再進入室內工作。甲醛對人的眼、鼻有強烈刺激作用。因此,可在使用前用氨進行中和。取與甲醛等量的氨水,倒在另一個燒杯里,迅速放入熏蒸室內,使甲醛和氨水發(fā)生中和反應,以消除甲醛味,減少對人體的刺激作用。使用氨水應在工作前2小時進行。 對有材料的培養(yǎng)室,也可以采用乙二醇加熱熏蒸。(二)接種室滅菌空氣消毒滅菌接種室超凈工作臺紫外燈照射70%75%的酒精擦洗培養(yǎng)材料的接種紫外燈照射(

12、三)外植體滅菌流水沖洗1020min或更長時間70%75%酒精中浸泡30s0.1%0.2%氯化汞液中浸泡10min左右蒸餾水沖洗45次在10%的次氯酸鈉、飽和漂白粉浸泡30min左右備用常用消毒劑消毒滅菌比較表消毒劑使用濃度(%)去除難易消毒時間(min)效果次氯酸鈣次氯酸鈉漂白粉溴水過氧化氫升汞酒精抗生素硝酸銀9102飽和溶液1210120.11707545(mg/L1易易易易最易較難易中較難5305305302105152100.223060530很好很好很好很好好最好好較好好污染來源人為因素(工作人員本身):工作服、帽、口罩、酒精擦手。物品因素器皿和用具培養(yǎng)皿:洗熱壓 玻璃器皿:洗干熱(

13、干熱箱)或晾干 接種用具:用CCL4布擦濕布擦 泡75%95%酒精燒培養(yǎng)基:濕熱培養(yǎng)材料外部細菌:用水沖洗化學藥劑處理 內部細菌 莖尖培養(yǎng) 加抗生素:青霉素、利福平操作的空氣:洗刷地板95%酒精擦超凈工作臺 用化學試劑薰蒸六、無菌操作技術1、實驗器具和材料的準備2、用75%的酒精擦拭超凈工作臺,然后室內及超凈工作臺用紫外燈殺菌20min-30min。注意:臺面上的用品不要放置太多或重疊放置,以免降低滅菌效果。3、關紫外燈、打開風機,過5-10min進入緩沖間,以75%洗手和手臂,更換無菌服、帽子和口罩。進入接種室。(注:沒有特別情況,盡量不要下工作臺)六、無菌操作技術4、用7075的酒精拭擦臺

14、面并消毒雙手。試驗用具也應該用酒精消毒。點燃酒精燈,將金屬器械在其火焰上灼燒,冷卻待用。注意:所有操作應在火焰近處并經(jīng)過灼燒進行。金屬器械不能過度灼燒,以防退火。移液管不能灼燒,培養(yǎng)瓶口、塑料材料、橡膠材料過火焰不能時間太長。5、取流水沖洗(至少30min)過的外植體,用一定的消毒劑浸泡消毒,用無菌水沖洗34次,放入無菌培養(yǎng)皿中,置于酒精燈火焰下方,用無菌的接種器械進行分離、切割或其他處理。6、打開培養(yǎng)瓶,瓶口在燈焰處旋轉灼燒,用鑷子將培養(yǎng)材料置于培養(yǎng)基上,灼燒鑷子放回,灼燒瓶口,蓋上瓶塞。7、用酒精擦洗工作臺和手。進行下一輪操作。注意(1)進行培養(yǎng)時,動作要準確敏捷,但又不必太快,以防空氣流

15、動,增加污染機會。(2)不能用手觸及已消毒器皿,如已接觸,要用火焰燒灼消毒或取備品更換。 (3)為拿取方便,工作臺面上的用品要有合理的布局,原則上應是右手使用的東西放置在右側,左手用品在左側,酒精燈置于中央。(4)工作由始至終要保持一定順序性,組織或細胞在未做處理之前,勿過早暴露在空氣中。同樣,培養(yǎng)液在未用前,不要過早開瓶;用過之后如不再重復使用,應立即封閉瓶口直立可增加落菌機會。(5)吸取營養(yǎng)液、細胞懸液及其它各種用液時,均應分別使用吸管,不能混用,以防擴大污染或導致細胞交叉污染。(6)工作中不能面向操作區(qū)講話或咳嗽,以免唾沫把細菌或支原體帶入工作臺面發(fā)生污染。(7)手或相對較臟的物品不能經(jīng)過開放的瓶口上方,瓶口最易污染,加液時如吸管尖碰到瓶口,則應將吸管丟掉。接種時在近火焰處打開瓶口,使瓶傾斜,以免空氣中微生物落入瓶中。正 確錯 誤

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