微生物學(xué) 實(shí)驗(yàn)2 細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色課件

1、一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、學(xué)習(xí)并掌握簡(jiǎn)單染色和革蘭氏染色的原理及步驟。 2、學(xué)習(xí)微生物涂片、染色技術(shù)和無菌操作。3、鞏固顯微鏡油鏡的使用技術(shù)。實(shí)驗(yàn)二 細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色法和革蘭氏染色法二、實(shí)驗(yàn)原理1、細(xì)菌的簡(jiǎn)單染色原理細(xì)菌菌體微小而透明，在普通光學(xué)顯微鏡下不易識(shí)別，必須通過染色來增加菌體的顯示力，從而更清楚地觀察到其形態(tài)和結(jié)構(gòu)。在堿性、中性或弱酸性溶液中，細(xì)菌菌體通常帶負(fù)電荷，而堿性染料在電離時(shí)，其分子的染色部分帶正電荷（酸性染料的染色部分帶負(fù)電荷），因此，堿性染料很容易與菌體結(jié)合而是菌體著色。2、細(xì)菌革蘭氏染色的原理G+菌和G-菌的細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)和組成有較大的區(qū)別。G+菌細(xì)胞壁中肽聚糖層厚且交聯(lián)度高，類脂質(zhì)含

2、量少，經(jīng)脫色劑處理后反而使肽聚糖層的孔徑縮小，通透性降低，結(jié)晶紫-碘復(fù)合物被滯留在細(xì)胞內(nèi)，因此細(xì)菌仍保留初染時(shí)的顏色，經(jīng)番紅復(fù)染后呈藍(lán)紫色。G-菌細(xì)胞壁的外膜層富含類脂，而且其肽聚糖層次薄、交聯(lián)度低；乙醇脫色時(shí)，細(xì)胞壁因類脂被溶解而出現(xiàn)較大縫隙，使得菌體內(nèi)的結(jié)晶紫-碘復(fù)合物較易滲出，而使菌體變成無色，再經(jīng)番紅復(fù)染就成為紅色。三、實(shí)驗(yàn)器材1、菌種：革蘭氏染色：培養(yǎng)12 h16 h的枯草芽孢桿菌120和培養(yǎng)24 h的大腸桿菌。2、染色液和試劑：結(jié)晶紫、碘液、95%酒精、沙黃或蕃紅3、器材：載玻片、接種杯、木夾子、酒精燈、擦鏡紙、顯微鏡。菌齡對(duì)革蘭氏染色結(jié)果的影響：選取處于活躍生長(zhǎng)期指數(shù)生長(zhǎng)期的菌體

3、進(jìn)行革蘭氏染色。菌體尚未成熟或菌體過老，可能使染色結(jié)果呈現(xiàn)相反的結(jié)果。（一）簡(jiǎn)單染色的步驟 （見P11）1、涂片：取干凈載玻片，火焰灼燒后，橫放于玻片架上； 在載玻片中央滴一小滴生理鹽水， 用接種環(huán)以無菌操作取少許菌體于水滴中（注：不要挑破培養(yǎng)基）， 混勻并涂成薄膜（注：涂片不易過厚）。2、干燥：用夾子夾住載玻片一端（菌膜面朝上），反復(fù)通過火焰高處數(shù)次， 烘干菌液（注：不能直接在火焰上烘烤，以免菌體變形）。3、固定：用夾子夾住載玻片一端，迅速通過火焰23次， 使菌體固定于載玻片上。4、染色：將玻片平放于玻片架上，加適量（以蓋滿菌膜為度）染液于涂片上。 染色時(shí)間1-2min。5、水洗：倒去染液，用洗瓶自載玻片的一端輕輕沖洗（切勿將菌膜沖掉）， 直至流下的水為無色為止。6、干燥：將玻片置于玻片架上，自然干燥或用吸水紙沿菌膜外緣吸干殘留水分。7、鏡檢：先用低倍鏡找到視野后，再換油鏡觀察 。四、實(shí)驗(yàn)步驟結(jié)晶紫碘 液95%乙醇番 紅初 染12min媒 染1min脫色2025s復(fù) 染2min繪出大腸桿菌和枯草芽孢桿菌的形態(tài)圖，并注明兩菌的革蘭氏染色的反應(yīng)性。（五）作業(yè) 大腸桿菌（10100） 枯草芽孢桿菌120（10100）大腸桿菌_ 色，革蘭氏_性菌；枯草芽孢桿菌120_ 色，革蘭氏_性菌。（六）思考與討論1、造成革蘭氏染色結(jié)果不正確（假陽(yáng)性或假陰性）的主要原因有哪些？2、如果某一