博邁德質(zhì)粒小量提取

1、質(zhì)粒小量提取試劑盒（磁珠法）目錄號(hào)：PL02試劑盒組成保存PL0202100次PL0203200次RNaseA（10mg/ml）-20C300pl300plX2溶液 P14C30ml30mlX2溶液 P2室溫30ml30mlX2溶液 P3室溫40ml40mlX225ml25mlX 2漂洗液 WB室溫第一次使用前按說明加指定量乙醇洗脫緩沖液 EB室溫15ml10mlX 2磁珠懸浮液室溫1.5ml1.5mlX 2保存條件：本試劑盒在室溫儲(chǔ)存 18 個(gè)月不影響使用效果。儲(chǔ)存事項(xiàng):第一次使用時(shí)，將試劑盒所帶的全部RNase A加入溶液P1后（終濃度100ug/ml） 置于2-8C保存。如果溶液P1中R

2、Nase A失活，提取的質(zhì)?？赡軙?huì)有微量RNA 殘留，在溶液P1中補(bǔ)加RNase A即可。環(huán)境溫度低時(shí)溶液P2中SDS可能會(huì)析出渾濁或者沉淀，可在37C水浴加熱幾分 鐘，即可恢復(fù)澄清，不要?jiǎng)×覔u晃，以免形成過量的泡沫。避免試劑長時(shí)間暴露于空氣中產(chǎn)生揮發(fā)、氧化、pH值變化。產(chǎn)品介紹：本試劑盒采用改進(jìn)SDS-堿裂解法裂解細(xì)胞，磁珠在高鹽、低pH值狀態(tài)下選擇性 地結(jié)合溶液中的質(zhì)粒DNA，再通過漂洗液將雜質(zhì)和其它細(xì)菌成分去除，最后低鹽、高 pH值的洗脫緩沖液將純凈質(zhì)粒DNA從磁珠上洗脫。產(chǎn)品特點(diǎn)：磁珠吸附量差異極小，可重復(fù)性好?？朔藝a(chǎn)試劑盒膜質(zhì)量不穩(wěn)定的弊端?？焖佟⒎奖?，不需要使用有毒的苯酚、氯仿

3、等試劑，也不需要乙醇沉淀。獲得的 質(zhì)粒產(chǎn)量高、純度好，可以直接用于酶切、轉(zhuǎn)化、PCR、體外轉(zhuǎn)錄、測(cè)序等各種 分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)。自備儀器及試劑：1，小型離心機(jī)，2 磁力架（博邁德），3 無水乙醇注意事項(xiàng)所有的離心步驟均在室溫完成，使用轉(zhuǎn)速可以達(dá)到13,000rpm的傳統(tǒng)臺(tái)式離心機(jī)， 如Eppendorf 5415C或者類似離心機(jī)。溶液P3中含有刺激性化合物，操作時(shí)要戴乳膠手套，避免沾染皮膚、眼睛和衣服。 若沾染皮膚、眼睛時(shí)，要用大量清水或者生理鹽水沖洗。提取質(zhì)粒的量與細(xì)菌培養(yǎng)濃度、質(zhì)?？截悢?shù)等因素有關(guān)。一般高拷貝質(zhì)粒，建議 接種單菌落于1.5-4.5 ml加合適抗生素的LB培養(yǎng)基，過夜培養(yǎng)14-1

4、6個(gè)小時(shí)，可提 取出多達(dá)20|ig的純凈質(zhì)粒。如果所提質(zhì)粒為低拷貝質(zhì)粒或大于1 Okb的大質(zhì)粒，應(yīng) 適當(dāng)加大菌體使用量，使用5-10 ml過夜培養(yǎng)物，同時(shí)按比例增加P1、P2、P3的用 量，其它步驟相同。得到的質(zhì)粒DNA可用瓊脂糖凝膠電泳和紫外分光光度計(jì)檢測(cè)濃度與純度。OD260 值為1相當(dāng)于大約50gg/ml DNA。電泳可能為單一條帶，也可能為2條或者多條DNA條帶，這主要是不同程度的超螺旋構(gòu)象質(zhì)粒泳動(dòng)位置不一造成，與提取物培養(yǎng)時(shí)間長短、提取時(shí)操作劇烈程度等有關(guān)。本公司產(chǎn)品正常操作情況下基本超螺 旋可以超過90%。質(zhì)粒DNA確切分子大小，必須酶切線性化后，對(duì)比DNA分子量Marker才可以

5、知 道。處于環(huán)狀或者超螺旋狀態(tài)的的質(zhì)粒，泳動(dòng)位置不確定，無法通過電泳知道其 確切大小。洗脫液EB不含有螯合劑EDTA,不影響下游酶切、連接等反應(yīng)。也可以使用水洗 脫，但應(yīng)該確保pH大于75, pH過低影響洗脫效率。用水洗脫質(zhì)粒應(yīng)該保存在一 20C。質(zhì)粒DNA如果需要長期保存，可以用TE緩沖液洗脫(10mM Tris-HCl，ImM EDTA，pH 8.0)，但是EDTA可能影響下游酶切反應(yīng)，使用時(shí)可以適當(dāng)稀釋。操作步驟：提示：O第一次使用前請(qǐng)先在漂洗液WB中加入指定量無水乙醇，充分混勻，加入后請(qǐng)及 時(shí)在方框打鉤標(biāo)記已加入乙醇，以免多次加入!O將RNase A全部加入溶液P1中，混勻，每次使用后

6、置于2-8C保存。O將溶液P3放在冰上預(yù)冷，可以提高產(chǎn)量。取1.5-4.5 ml過夜培養(yǎng)的菌液，9,000rpm離心30秒，盡可能的倒干上清，收集菌 體。用250皿溶液P1重懸菌體沉淀，渦旋振蕩至徹底懸浮。加250皿的溶液P2，溫和地上下翻轉(zhuǎn)4 -7次使菌體充分裂解。加350皿溶液P3,立即溫和地上下翻轉(zhuǎn)4 -7次，充分混勻時(shí)會(huì)出現(xiàn)白色絮狀沉淀， 13,000rpm 離心 5 分鐘，小心取上清。將上一步所得上清加入新的 1.5ml 離心管， 再加入 15ul 的磁珠懸浮液，震蕩混勻，放置5 分鐘，（如需高產(chǎn)量，可放置 10 分鐘）期間混勻幾次。把離心管放到磁力架上，靜置30sec，磁珠自動(dòng)被吸附在管壁，吸棄上清，磁珠 分離要在磁力架上完成。加入500皿漂洗液WB （請(qǐng)先檢查是否已加入無水乙醇!），顛倒混勻，放到磁力 架上，靜置 30 秒，吸棄上清，磁珠分離要在磁力架上完成。重復(fù)7一次。吸凈液體，室溫放置5分鐘，確保乙